نوع مقاله : مروری
نویسندگان
1 گروه پدافند غیرعامل، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران، ایران
2 کمیته تحقیقات دانشجویی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی خراسان شمالی، بجنورد، ایران.
3 دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی خراسان شمالی، بجنورد، ایران
4 گروه بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران.
چکیده
کلیدواژهها
مقدمه
فلزات جزو عناصر ضروری برای حیات انسان هستند. در این رابطه یکسری از این مواد مانند، کروم، کبالت، مس، آهن، منگنز، مولیبدنوم، سلنیوم و روی برای بدن ضروری و بعضی نیز سمی هستند مانند نقره، آلومینیوم، آرسنیک، کادمیوم، سرب، نیکل و جیوه. معمولاً یونهای فلزی نقش دوگانهای در فیزیولوژی بدن انسان دارند. به طوری که تعدادی برای انسان ضروریاند، در حالی که اکثر آنها در غلظتهای بالا سمی هستند [1-3]. به دلیل بروز امراض متنوع در سالهای اخیر، مطالعات زیادی روی اپیدمی آنها صورت گرفته است. یافتهها مشخص کردهاند که بین بروز چند بیماری در انسان مانند بیماریهای قلبیعروقی، اختلالات کلیوی و شکلهای مختلفی از سرطان با وجود فلزات سمی ارتباط مستقیمی وجود دارد [4]. در این خصوص با توجه به فراگیر بودن آلودگی اغلب مواد غذایی با سرب، در این مقاله به طور مفصل راجع به آن بحث میشود. سرب یکی از فلزات سنگین با سمیت بالاست که مخاطرات جدی برای محیط و انسان ایجاد میکند. تجمع سرب در بدن انسان منجر به سمیت شدید اعضای بدن از جمله کلیهها، کبد، سیستم عصبی و سیستم تولید مثل میشود. سازمان بهداشت جهانی و آژانس حفاظت محیط زیست حداکثر غلظت مجاز یون سرب را در آب شرب را 10 تا 50 میکروگرم بر لیتر گزارش کردهاند. حداکثر غلظت مجاز یون سرب در خون با توجه به دستورالعمل مرکز کنترل بیماریها و پیشگیری، 10 میکروگرم بر دسیلیتر است. همچنین آژانس بینالمللی تحقیقات سرطان حداکثر مقدار سرب را پایینتر از 10 بخش در میلیارد در مواد غذایی معرفی میکند [5-10].
طیفسنجی جذب اتمی، طیفسنجی جرمی القایی کوپل شده پلاسما، طیف سنجی نشری اتمی کوپل شده القایی پلاسما، طیفسنجی جذب اتمی کوره گرافیت، ولتامتری آندی و اسپکتروسکوپی فلورسانس اشعه ایکس از روشهای معمول و دستگاهی برای آشکارسازی و تشخیص یونهای سرب هستند. این روشها معمولاً دستگاهی و پرهزینه هستند. ضمن اینکه نیاز به آزمایشگاه خاص و افراد متخصص دارند و از طرف دیگر نیاز به تجهیزات پیچیده داشته و مدتزمان آنالیز نمونه نیز زیاد است. بنابراین یافتن روشهای ارزان، ساده با حساسیت بالا و انتخابی از اهمیت ویژهای برخوردار است [11].
با پیشرفت علم و توسعه روشهای نوین تشخیصی در سال 1983 جرقهای در زمینه ایجاد روشهای جدید و غیردستگاهی زده شد. سنسورهای شیمیایی و بیوسنسورها نمونه بارزی از این روشها هستند. این روشها معمولاً بهمراتب کم هزینهتر و سادهتر از روشهای اشارهشده هستند. اوج سادگی این سنسورها را میتوان در کیتهای اندازهگیری مواد مخدر، تشخیص حاملگی و قند خون ملاحظه کرد. از رایجترین روشهای بیوسنسوری، روشهای مبتنی بر آنتیبادی است که خود به دلیل داشتن محدودیتهای تولید در حیوانات، هزینه بالا و مشکلات خاص کارکرد با آنها، محققان را به ابداع روشهای سادهتر و مطمئنتر ترغیب کرده است. مدت کمی پس از کشف RNA محققان پی بردند RNA علاوه بر نقشی که در ترجمه و سنتز پروتئین دارد، قادر به تشکیل ساختارهای دوبعدی و سهبعدی است و میتواند به طور اختصاصی به مولکولهای هدفش متصل شود. این ایده بر پایه مشاهده فرایندهای تنظیم ژنی سلولی و واکنش هایی که انجام آنها مستلزم اتصال DNA یا RNA به یک ترکیب شیمیایی مکمل و تشکیل کمپلکس بود، شکل گرفت. این اتصالات مولکولی بر اساس اصول شناسایی سطحی و شامل انواع اتصالات مولکولی از جمله پیوندهای هیدروژنی، هیدروفوبیک و یونی است [12-15].
ویژگیهای آپتامر و فرایند انتخاب آپتامر
آپتامر را میتوان آنالوگ نوکلئیک اسیدی آنتیبادی دانست. آنها میتوانند با تمایل بسیار زیاد و به صورت اختصاصی به هدفشان متصل شوند [16-19]. توانایی اتصال نوکلئیک اسید به مولکولها اولین بار ضمن تحقیقاتی درباره ویروس HIV و آدنوویروسها در دهه 80 میلادی مورد توجه قرار گرفت. آپتامرها میتوانند با ثابتهای تفکیک بسیار پایین در حد نانومولار و پیکومولار به طور اختصاصی به هدف متصل شوند. در حال حاضر آپتامرهای نوکلئیک اسیدی برای بیش از 150 هدف متفاوت تهیه شدهاند که شامل مولکولهای کوچک مثل کوکائین و آسپارتام، فاکتورهای رشد، پپتیدها، سموم، پروتئینهای ویروسی و سلولها و باکتریهاست. در بین آنها برخی مانند آپتامر علیه پروتئین فاکتور رشد اندوتلیال عروقی برای بیماری چشمی تخریب ماکولایی وابسته با سن مورد تایید سازمان غذا و داروی آمریکا قرار گرفته است. همچنین اخیراً دارورسانی هدفمند با استفاده از نانوذرات پلیمری و آپتامرها برای سرطانهای مختلف به صورت درونتنی مورد مطالعه قرار گرفته است. این ویژگیها نشان میدهد آپتامرها پتانسیل زیادی جهت کاربرد در حوزههای تشخیصی و درمانی دارند. فرایند جداسازی آپتامرهاSELEX نامیده میشود. SELEX یک تکنیک برونتنی برای انتخاب، تکثیر و غنیسازی الیگونوکلئوتیدهای تکرشتهای که برای هدف مورد نظر اختصاصی هستند از میان یک کتابخانه توالی رندوم است [20-22]. نقطه شروع در SELEX ایجاد یک خزانه DNA یا RNA است که حاوی 1014- 1015 قطعه تکرشتهای DNA یا RNA است که توالی منطقه وسط آنها تصادفی است و معمولاً 20-80 نوکلئوتید است و دو توالی مشخص و ثابت در دو طرف آنها وجود دارد که معمولاً 18-21 نوکلئوتید است [23-25].
آپتامرها الیگونوکلئوتیدهای کوتاه تکرشتهای DNA و یا RNA و یا پروتئینهای اختصاصی هستند که این توانایی را دارند که به طور اختصاصی به هدفشان متصل شوند و اساس شناسایی هدف توسط آپتامرها، ساختار سوم تشکیلشده توسط آنهاست. این اولیگونوکلئوتیدها و پپتیدها در اوایل دهه 1990 ابداع شدند. همچنین این ترکیبات قادر به متصل شدن به آنزیمها و گیرندهها بوده و باعث تغییر در فعالیت آنها میشوند. از این خاصیت در تولید آپتامرهای دارویی نیز استفاده میشود. آپتامرها از طریق تطابق شکل سهبعدی، اتصال حلقههای آروماتیک ترکیبات و نوکلئیک اسید در آپتامر، برهمکنشهای الکتروستاتیکی بین گروههای باردار و یا پیوندهای هیدروژنی به ترکیبات دیگر متصل میشوند [26، 27].
آپتامرها میتوانند حتی بین مولکولهای کایرال تفاوت قائل شوند و قادر هستند یک اپی توپ متفاوت از مولکول هدف را تشخیص بدهند. درنتیجه میتوانند بین دو هدف مرتبط و نزدیک مانند کافئین و تئوفیلین تفاوت قائل شوند [28]. از نظر اندازه، آپتامرهای الیگونوکلئوتیدی (kDa52-8) بین آنتیبادی (150 kDa) و پپتیدهای کوچک (5-1 kDa) قرار دارند [29]. در اینجا بیشتر بحث ما بر روی آپتامرهای الیگونوکلئوتیدی است.
کاربردهای آپتامر
امروزه آپتامرها در زمینههای گوناگونی کاربرد دارند. سنسورهای مبتنی بر آپتامر که آپتاسنسور نامیده میشوند، در تشخیص بازه وسیعی از آلایندههای غذایی و محیطی از قبیل آلودهکنندههای محیطی، سموم و پاتوژنها به کار میرود. ویژگیهای خاص آپتامرها باعث شده است که در حوزههای تشخیصی، بالینی و صنایع دارویی کاربرد وسیعی داشته باشند. به رغم مزایای زیاد آپتامرها، پژوهش در این زمینه هنوز در آغاز راه است. آپتامرها به عنوان عوامل درمانی و تشخیصی شروع به رقابت با آنتیبادیها کردهاند. در این زمینه آپتامرهای متعددی با توجه به عملکرد بالقوه آنها مورد آزمایش قرار گرفتهاند. ترکیب اختصاصیت و میل پیوندی خوب آپتامرها برای هدفهایشان، آنها را به یک وسیله ایدهآل برای تشخیص و درمان تبدیل کرده است. حوزههای کاربرد آپتامرها به طور خلاصه در ادامه آمده است [30].
درمانی
علاوه بر مواردی که در آن آپتامرها برای دارورسانی استفاده میشود، همانطور که اشاره شد خود اولیگونوکلئوتیدها به عنوان دارو نیز استفاده میشوند. آپتامرهای بسیاری مراحل مختلف توسعه پیشبالینی را طی کردهاند. برخی در مراحل اولیه کارآزمایی بالینی هستند و در حال حاضر یکی از اینها به صورت دارو در بازار موجود است. پتانسیل درمانی آپتامرهای تکرشته در این است که آنها به طور مستقیم به یک ساختار سهبعدی خاص که میل بالایی برای اتصال به پروتئین هدف دارد، تبدیل شده و میتوانند مانع از عملکرد پروتئین هدف شوند. اولین آپتامر با عملکرد درمانی به نام پگاپتانیب در سال 2004 توسط اداره دارو و غذای آمریکا تأیید و در سال 2005 روانه بازار شد و این آپتامر در بیماری چشمی تخریب ماکولایی وابسته با سن به کار میرود. در این بیماری شبکیه چشم آسیب دیده و بینایی در مرکز شبکیه به نام ماکولا از دست میرود. این آپتامر با اتصال به پروتئین فاکتور رشد اندوتلیال عروقی و مهار عملکرد آن عروقزایی را مهار و باعث بهبود بینایی میشود. محصول تجاری آن Macugen نام دارد [31].
جداسازی تمایلی
کاربرد فوق به خاطر خصوصیاتی است که آپتامرها دارند.
اعتبارسنجی هدف
بسیاری ازآپتامرها باعث مهار عملکرد هدف خود میشوند و معمولاً مهارکنندههای بسیار قوی پروتئین هستند [18].
انتقال هدفمند
انتقال هدفمند داروها و مواد ژنتیکی به سلولهای سرطانی با استفاده از اختصاصیت و میل اتصال بالای آپتامرها، آنها را به یک ترکیب ایدهآل برای انتقال هدفمند مولکولهای دارویی تبدیل کرده است. این امر بهویژه در مواردی مثل درمان سرطان که در آن مشکل درمان در این واقعیت نهفته است که بسیاری از داروهای تجویزشده به صورت غیر هدفمند وارد تمام سلولها میشوند، نمود پیدا کرده است [32، 33].
تشخیصی
بازار بزرگ تشخیص ایمونولوژیک در زمینههای پزشکی، آلودگیهای محیطی و منابع غذایی، رقابت بین کیتهای آزمایشگاهی مبتنی بر آنتیبادی و آپتامر را افزایش داده است. از این دست میتوان به کیت یکبارمصرف نواری برای تشخیص آلرژی اشاره کرد که در آن از آپتامر ایمونوگلوبینE استفاده شده و بر اساس آپتامر D17.4 طراحی شده است. مثال دیگر استفاده از آپتامر به جای آنتیبادی، سنجش الیگونوکلئوتید متصل به آنزیمELONA است که بر اساس روش ELISA عمل میکند [34]. از آنجا که آپتامرها برای مولکول هدف اختصاصی هستند و بهراحتی با مواد فلورسانس یا رادیوایزوتوپها نشاندار میشوند، ابزاری مناسب به منظور استفاده در کیتهای تشخیصی هستند [19، 29، 34، 35]. همچنین از کاربردهای دیگر آپتامرها میتوان به تشخیص سموم شیمیایی، فلزات سنگین، باقیمانده آنتیبیوتیکها در مواد غذایی، مواد مخدر و مواد دارویی اشاره کرد [36-52].
روشهای متنوع شناسایی سرب بر مبنای آپتامر
سرب به صورتهای مختلف وارد بدن انسان، حیوان و گیاه میشود. سرب میتواند از طریق آبهای آلوده وارد آبهای شرب شده، از طریق اگزوز اتومبیلها وارد هوا و ریه شود و از طریق دودکش کارخانهها وارد هوا و بعد وارد مواد غذایی شود. با این حال هوای آلوده به سرب مهمترین عامل گسترش این آلودگی است. سرب واردشده در هوا را بهسختی میتوان کنترل کرد. آنچه سبب نگرانی است، تأثیر طولانیمدت سرب بر روی محیط زیست است. با توجه به گستردگی آلودگی با سرب و معضلات ناشی از آن، روشهای تشخیصی نیز رو به گسترش بوده و محققین برای رفع این مشکل، فعالیتهای زیادی را آغاز کردهاند. یکی از کاربردهای آپتاسنسورها، استفاده از آنها برای تشخیص آلودگی سرب است. استفاده از آپتامرها به عنوان جزء تشخیصی در بیوسنسورها مزایایی از قبیل امکان استفاده مجدد از بیوسنسور و استفاده از روشهای شناسایی متنوع (به دلیل نشاندار کردن راحت آپتامرها) را فراهم میکند. اندازه کوچک و تطبیقپذیری آپتامرها اجازه ثابت کردن مؤثر آنها و امکان ساخت تک لایههایی با تراکم بالا را میدهد. روشهای شناسایی متداول مورد استفاده در این سنسورها عبارتاند از: الف) روشهای نوری (فلورسانس، رنگسنجی و لومینسانس)؛ ب)روشهای الکتروشیمی (پتانسیومتری ، آمپرومتری و ...)؛ ج) سایر روشها متداول.
روشهای نوری برای تشخیص یون سرب
آپتاسنسورهای نوری شامل مبدل هایی هستند که سیگنالها را از یک واکنش شیمیایی/ بیولوژیکی / فیزیکی گرفته و آنها را به فرمتهای مختلف داده تبدیل میکنند. این نوع سنسورها به انواع مختلف رنگسنجی، فلورسانس، لومینسانس و پلاسمون سطحی طبقهبندی میشوند. بزرگترین ویژگی بالقوه این سیستمها امکان انجام اندازهگیریهای بدون نیاز به نشانهگذاری و سیستمهای قابل حمل چندگانه، ارزان و ساده است. نشانهگذاری و اصلاح آپتامرها گاه پرزحمت، وقتگیر و پرهزینه است که میتواند به نوبه خود سبب تضعیف میل پیوندی آپتامر نیز بشود. لذا آپتامرهای فاقد نشانه به عنوان یک استراتژی جایگزین توسعه یافتهاند. نانوتکنولوژی امکان تولیدساختارهای نانوی پیچیده را برای هدایت نور فراهم کرده است که به نوبه خود دریچهای برای جستوجوی پدیدههای نوری جدید و ویژگیهای نوری مواد در سطح نانو مولار گشوده است [53، 54].
آپتاسنسورهای رنگسنجی برای تشخیص سرب
روشهای رنگسنجی از جمله روشهای ارزان و راحت هستند که عمدتاً از نانوذرات فلزی طلا به دلیل خواص نوری منحصربهفرد آن نظیر رزونانس پلاسمون سطحی کانونی و ضریب خاموشی بالا در نور مرئی استفاده میشود. شکل و ابعاد نانوذرات طلا در رزونانس پلاسمون سطحی خیلی مؤثر است و حداکثر آن در ابعاد 13 نانومتر نانوذره به وجود میآید که در حالت عادی در طول موج مرئی 520 نانومتر به صورت قرمز نمایان میشود و در صورت تجمع نانوذرات با شیفت طول موج به 650 نانومتر به رنگ بنفش ظاهر میشود [55].
الف) آپتاسنسور رنگسنجی بر اساس نانوذرات طلا و پلیمر پلیاتیلن ایمین برای تشخیص یون سرب: بر اساس این روش تیم تحقیقاتی ما در دانشکده داروسازی مشهد، یک آپتاسنسور رنگسنجی جدید برای تشخیص یون سرب بر اساس نانوذرات طلا و پلیمر پلیاتیلن ایمین طراحی کرده و به نتایج خوبی نیز دست یافت (تصویر شماره 1).
مکانیسم این سیستم طوری است که در عدم حضور یون سرب، آپتامر به صورت الکتروستاتیک به پلیمر وصل شده و نانوذرات طلا بدون تغییر رنگ محافظت میشود، زیرا پلیمر پلیاتیلن ایمین به عنوان یک پلیمر کاتیونی توسط آپتامر که حاوی بار منفی است پوشیده شده و امکان برهمکنش با نانوذرات طلا را ندارد، ولی در حضور یون سرب، آپتامر به هدف متصل شده و یک کمپلکس با شکل فضایی خاص ایجاد میکند. در این صورت پلیمر در محیط آزاد بوده و باعث تجمع نانوذرات طلا شده و درنهایت رنگ بنفش نمایان میشود. حد تشخیص این سنسور در آب آشامیدنی 0/7 نانومولار به دست آمد و در سرم که نمک سرب به آن اضافه شده بود، حد تشخیص 2/25 نانومولار است. این مقدار از سطح مجاز سرب در خون که توسط مرکز کنترل و پیشگیری از بیماریها (CDCP) بسیار پایینتر است. قابل ذکر است سرم به دلیل داشتن قطعات پروتئینی و ایجاد اثر کرونا مانع از تجمع نانوذرات طلا میشود. به همین خاطر سرم قبل از استفاده باید در حد مطلوبی رقیق شود.
ب) آپتاسنسور براساس ساختمان مولکولی تریپل هلیکس و فعالیت پراکسیدازی نانوذرات طلا برای تشخیص یون سرب: تیم تحقیقاتی ما بر این مبنا آپتاسنسور دیگری طراحی کردند که بر اساس یک ساختمان مولکولی تریپل هلیکس (THMS) و فعالیت پراکسیدازی نانوذرات طلاست. THMS از دو بخش اولیگونوکلئوتیدی تشکیل شده است. بخش اول آن ساختار سنجاق سر دارد که آپتامر در این بخش قرار گرفته است و بخش دوم آن یک توالی کوتاه است که مکمل بخش ساقه ساختار اول است. در عدم حضور هدف، ساختار THMS حفظ میشود. لذا به علت ساختار سختی که THMS دارد بر روی نانوذرات طلا قرار نخواهد گرفت و سطح نانوذرات طلا آزاد است. لذا نانوذرات طلا میتوانند TMB را اکسید کنند و رنگ آن از بیرنگ به آبی تغییر خواهد کرد. اما در حضور سرب، به دلیل وصل شدن آپتامر به سرب، ساختار THMS باز شده و توالی کوتاه آزاد میشود و روی سطح نانوذرات طلا از طریق پیوندهای واندروالس و الکتروستاتیک قرار میگیرد. بنابراین به علت پوشیده شدن سطح نانوذرات طلا، دیگر نانوذرات طلا فعالیت پراکسیدازی نخواهند داشت و TMB اکسید نخواهد شد و رنگ نمونه بیرنگ باقی خواهد ماند. حد تشخیص این آپتاسنسور در آب شرب 0/708 نانومولار و در سرم 2/07 نانومولار محاسبه شده است. در این آپتاسنسور نیز با توجه به تداخل پروتئینهای سرم با نانوذرات طلا، با استفاده از ترکیب شیمیایی استونیتریل پروتئینهای سرم از نمونه سرم حذف شد [40].
ج) آپتاسنسور با استفاده ازنانوذرات طلا و میکروفلویدیک مبتنی بر کاغذ: در یک کار تحقیقاتی، نانوذرات طلا با آپتامر سرب اصلاح شدند و روی یک چاهک میکروفلویدیک قرار گرفتند. سپس سرب با غلظتهای مختلف به چاهک حاوی نانوذرات طلای اصلاحشده با آپتامر اضافه شد. در حضور سرب، آپتامرها از سطح نانوذرات طلا جدا شدند. در گام بعد، نمک به یکی دیگر از چاهکهای میکروفلویدیک اضافه شد که بعد از رسیدن به چاهک حاوی نانوذرات طلا منجر به رسوب و تغییر رنگ نانوذرات طلا از قرمز به آبی شد. حد تشخیص سنسور طراحیشده در آب 0/7 نانومولار است [56].
د) آپتاسنسور رنگسنجی با استفاده ازنانوذرات طلای اصلاحشده با DNA دورشتهای و آنزیم اگزونوگلئاز I: تیم تحقیقاتی ما یک آپتاسنسور رنگسنجی با استفاده از نانوذرات طلا و DNA دورشتهای برای شناسایی سرب طراحی کردند (تصویر شماره 2).
این سنسور بر اساس آنزیم اگزونوکلئاز I کارایی خود را اعمال میکند. اگزونوکلئاز I به صورت اختصاصی DNA تکرشتهای را از سمت '3 تجزیه میکند. ابتدا آپتامر یون سرب با توالی مکمل تیوله با استوکیومتری مشخص متصل شده، سپس این ساختار دورشتهای بر روی نانوذرات طلا تثبیت میشود. در حضور یون سرب، آپتامر به سرب متصل شده و از سطح نانوذرات طلا جدا میشود و توالی تکرشتهای مکمل که به صورت آزاد در سطح نانوذرات طلا وجود دارد، توسط آنزیم اگزونوکلئازI تجزیه شده و نانوذرات طلا عملاً بدون پوشش میشود. در این صورت با افزودن نمک، نانوذرات طلا رسوب کرده و از حالت قرمز به بنفش تغییر رنگ مییابد. در غیاب یون سرب، آپتامر سرب و توالی مکمل تیوله که به نانوذرات طلا متصل هستند، بدون تغییر مانده و آنزیم اگزونوکلئاز I تأثیری روی آن به عنوان یک DNA دورشتهای ندارد. بنابراین در حضور نمک نیز تغییر رنگی رخ نمیدهد. آپتاسنسور طراحیشده به صورت انتخابی و با حساسیت خوب برای تشخیص سرب کارایی داشت. حد تشخیص آپتاسنسور 2/4 نانومولار تعیین شد [57].
ذ) آپتاسنسور رنگسنجی با استفاده از خواص پلاسمونیکی نانوذرات طلا در حضور یک پپتید کاتیونی: محقیقین در یک پروژه تحقیقاتی، یک حسگر جدید برای تشخیص سریع یونهای سرب با استفاده ازخواص نوری نانوذرات طلا، آپتامر اختصاصی برای سرب و یک پپتید کاتیونی (حاوی شش اسیدآمینه) ارائه کردهاند که حد تشخیص آن 98/7 پیکومولار است (تصویر شماره 3).
در این آپتاسنسور، اتصال آپتامر به یونهای سرب به منظور توسعه بیوسنسور رنگسنجی بسیار حساس مورد استفاده قرار گرفته است. مکانیسم سنسور طوری است که آپتامر وقتی به طور اختصاصی به یون سرب متصل میشود، دیگر پپتید کاتیونی قابلیت اتصال به آپتامر را ندارد و در محلول آزاد میماند. درنتیجه، پپتیدهای کاتیونی آزاد منجر به تجمع نانوذرات طلا شده و تغییر رنگ مشخصی از قرمز شرابی به آبی مشاهده میشود. اتصال الکترواستاتیک بین نانوذرات طلا با بار منفی و پپتید کاتیونی مسئول ایجاد تغییرات رنگ است و این تغییرات با چشم غیرمسلح بهوضوح قابل مشاهده است. اما در غیاب یونهای سرب، آپتامر و پپتید از طریق فعل و انفعالات الکترواستاتیک به هم متصل شده، در این صورت نانوذرات طلا در محیط به صورت پراکنده باقی میمانند و تغییر رنگی مشاهده نمیشود [58].
آپتاسنسورهای فلورسانس برای تشخیص سرب
فلورسانس یکی از معمولترین روشهای نوری است که به صورت وسیعی در طراحی آپتاسنسورها استفاده میشود. این کاربرد زیاد به خاطر کاربری راحت، بازدهی مناسب و حساسیت مطلوب این روش است. روشهای فلورسانس برچسبدار هستند یا بدون برچسب. در آپتاسنسورهای بدون برچسپ، هیچگونه فلورفور یا کروموفور استفاده نمیشود، در صورتی که در نوع برچسبدار وجود فلورفور یا کروموفور ضروری است. در این روش تشخیصی، تعداد زیادی از فلورفورها و خاموشکنندههای فلورسانس وجود دارند که بهراحتی با نوکلئوتیدها کونژوگه میشوند و باعث انتقال انرژی رزونانسی فلورسانس، انتقال انرژی رزونانسی لومینسانس یا خاموش کردن انتقال الکترون ناشی از این فرایند هستند [59].
الف) تشخیص سرب دوظرفیتی به صورت اختصاصی و با حساسیت مناسب با استفاده از یک آپتاسنسورفلورسانس بدون برچسبدار: در سال 2016 هیوانگ و همکاران یک آپتاسنسور فلورسانس را برای تشخیص سرب معرفی کردند. این تیم تحقیقاتی برای رسیدن به تشخیص بسیار حساس و انتخابی یون سرب، یک حسگر حساس بدون بر چسب مبتنی بر DNA دورشتهای و رنگ فلورسانس پیکوگرین طراحی کردند (تصویر شماره 4).
اساس این روش این است که آپتامر متصلشده به مکملش در حضور سرب از مکمل جدا شده و فرم ساختار جی کوادروپلکس را به خود میگیرد. در این حالت با افزودن رنگ فلورسانس پیکوگرین که به طور اختصاصی به DNA دورشتهای متصل میشود، شدت فلورسانس ضعیفی مشاهده میشود (به خاطر نبود DNA دورشتهای در محیط). برعکس در عدم حضور یون سرب، آپتامر و رشته مکملش تشکیل توالی دورشتهای داده و پیکوگرین در داخل دو رشته ذخیره شده و شدت فلورسانس زیاد مشاهد میشود. حد تشخیص این روش 1 نانوگرم بر میلیلیتر است. آپتاسنسور طراحیشده سریع وکاملاً اختصاصی است و در حضور یونهای فلزات دیگر نظیر + Ag+ ،Cu2+ ،Li+ ،Zn2+ ،Na+ ،Ca2+ ،Mg2+ ،K+ و +2 Hg کارایی مطلوبی داشت. در مقایسه با دیگر آپتاسنسورهای فلورسانس برای تشخیص یون سرب، در سیستم پیشنهادشده نیاز به اصلاح DNA نیست به همین دلیل این روش، یک روش تجزیهای ساده و مقرونبهصرفه برای تشخیص یون سرب است. همچنان که اشاره شد این روش تشخیصی سریع، ساده، حساس است و کاربری راحتی برای تشخیص یون سرب دارد. همچنین این روش میتواند در تشخیص آلودگی آبهای محیطی به کار برده شود. مدت زمان تشخیص کمتر از 30 دقیقه است [60].
ب) تشخیص اختصاصی و انتخابی +Pb 2 با استفاده از آپتاسنسور فلورسانس بر مبنای نانو کلاستر نقره: در یک مطالعه انجامشده دیگر در کشور چین یک آپتاسنسور فلورسانس با استفاده از توالی آپتامر و نانوکلاسترهای نقره با قطر متوسط 1 نانومتر طراحی و ساخته شد (تصویر شماره 5).
این سیستم، ساده، حساس و انتخابی و در غلظت پایین یون سرب کارایی دارد. شدت فلورسانس کمپلکس (آپتامر توالی الیگونوکلئوتیدی جایگاه تشکیل نانوکلاستر نقره نانوکلاستر نقره) به طور قابل ملاحظهای درحضور یون سرب افزایش مییابد که به تعامل ویژه بین یون سرب و توالی آپتامر مربوط میشود. در حضور یون سرب، آپتامر سرب تشکیل یک جی کوادروپلکس با بازهای گوانین را میدهد و باعث میشود کمپلکس نانوکلاستر نقره در دو انتهای ′3 و ′ 5 (محل توالی الیگونوکلئوتیدی جایگاه تشکیل نانوکلاستر نقره که به دو انتهای آپتامر اضافه شده است) در مجاورت هم قرار بگیرند. درنتیجه نور فلورسانس ارتقا پیدا میکند. برعکس در غیاب یون سرب، سیستم بدون تغییر مانده و کمپلکسهای حاصل به علت دور بودن از یکدیگر فاقد فلورسانس هستند. حد تشخیص این آپتاسنسور حدود 3 نانومولار است. دقت و قیمت مناسب، تکرارپذیری و زیست سازگاری از ویژگیهای دیگر این آپتاسنسور است. همین دلایل باعث شده تا برای تشخیص آلودگی یون سرب در نمونه آبهای طبیعی و حقیقی به کار برده شود [61].
ج) آپتاسنسور فلورسانس بر اساس روش میکروفلوئیدی برای تشخیص یون سرب: اخیراً لانگ و همکارانش یک بیوسنسور فلورسانس بر مبنای آپتامر جی کوادروپلکس و روش میکروفلوئیدی برای شناسایی سرب معرفی کردند. در این سیستم، ابتدا رشتههای مکمل آپتامر بر روی حسگر فیبر نوری تثبیت شدند. در این روش، در غیاب یون سرب، آپتامرنشاندارشده با فلوروفور Cy5 به رشته مکمل خود متصل شده و DNA دورشتهای تشکیل میدهد. در این صورت شدت فلورسانس افزایش مییابد. زمانی که مخلوط یون سرب و آپتامر به سل نوری اضافه میشود، بخشی ازآپتامر به یون سرب متصل شده و منتج به تغییر شکل آپتامر از حالت تصادفی به جی کوادروپلکس پایدارشده با یون سرب میشود. بنابراین با افزایش غلظت یون سرب، اتصال آپتامر نشاندارشده به سطح سنسور کاهش مییابد. به همین خاطر شدت فلورسانس کم میشود. از ویژگیهای این روش میتوان به تشخیص آسان، قابل حمل بودن و تشخیص سریع هدف در حداقل حجم نمونه در یک آنالیت چندتایی اشاره کرد. انتخابیت این سنسور در حضور یونهای پتاسیم، جیوه و نقره مورد ارزیابی قرار گرفته و نتایج خوبی نیز به دست آمد. حد تشخیص سنسور 0/22 نانومولار است [62].
د) آپتاسنسور فلورسانس بر اساس نقاط کوانتومی برای تشخیص یون سرب: نقاط کوانتومی، ذرات نانومتری نیمههادی هستند که از یک هسته فلزی سنگین مانند کادمیوم، سلنیوم و یک پوشش خارجی مشتمل بر مولکولهای متنوع با فعالیت زیستی و متناسب با کاربرد خاص تشکیل شدهاند. با توجه به مزیتهای نقاط کوانتومی نسبت به رنگهای معمولی، مانند اندازه کنترلشده فلورسانس، بهره کوانتومی بالا و پایداری در برابر عکسبرداری، این ترکیبات در بیوحسگرها مورد توجه زیادی قرار گرفتهاند [55، 63]. در همین رابطه لی و همکارانش یک آپتاسنسور فلورسانس Turn-on بر مبنای نقاط کوانتومی و آپتامر گرافن اکسید برای تشخیص یون سرب معرفی کردند (تصویر شماره 6).
مکانیسم عمل بدین شرح است که ابتدا نقاط کوانتومی با آپتامر اختصاصی یون سرب کونژوگه میشود که یک نشر فلورسانس شدید در 567 نانومتر دارد. سپس لایههای گرافن اکسید با آپتامر نشاندارشده با نقاط کوانتومی ترکیب میشود. آپتامر نشاندارشده با نقاط کوانتومی بر روی گرافن اکسید قرار گرفته و انتقال انرژی از نقاط کوانتومی به لایههای گرافن اکسید انجام گرفته و فلورسانس نقاط کوانتومی خاموش میشود. با افزایش یون سرب به دلیل برهمکنش آپتامر با یون سرب، ساختار جی کوادروپلکس تشکیل میشود و آپتامر از سطح گرافن اکسید جدا میشود. بنابراین، نقاط کوانتومی از لایههای گرافن اکسید جدا شده و فلورسانس سنسور دوباره برقرار میشود. حد تشخیص این آپتاسنسور در نمونه واقعی (آب رودخانه) 0/26 نانومولار است [64].
ذ) آپتاسنسور فلورسانس بر اساس کاغذ برای تشخیص یون سرب: در این مطالعه، یک آپتاسنسورفلورسانس ساده بر اساس کاغذ برای تشخیص حساسیت یون سرب در مدتزمان حدود 10 دقیقه ساخته شد. این سنسور با استفاده از فرایند انتقال انرژی رزونانس (FRET) و خاصیت خاموشکننده گرافن اکسید طراحی شده است (تصویر شماره 7).
مکانیسم سنجش بر اساس سوئیچ کنفورماسیونی آپتامر اختصاصی یون سرب از یک ساختار تصادفی به یک ساختار جی کوادروپلکس استوار است. در این آپتاسنسور، وجود یون سرب روی سکوی مبتنی بر کاغذ، باعث آزادسازی آپتامر نشاندارشده با FAM از سطح گرافن اکسید میشود. درنتیجه شدت فلورسانس زیاد میشود. در غیاب سرب، آپتامر نشاندار همچنان در مجاورت گرافن اکسید باقی خواهد ماند که این موضوع باعث خاموش شدن فلورسانس ماده فلوروفور میشود. لذا شدت فلورسانس کاهش مییابد. حد تشخیص این سنسور 0/5 پیکومولار است. این آپتاسنسور با موفقیت برای تعیین یون سرب در آب شیر، آب دریاچه، شیر و سرم خون انسان استفاده شد [65].
نتیجهگیری
سمیت فلزات سنگین و تجمع آنها در زنجیره غذایی یکی از اصلیترین معضلات زیستمحیطی و بهداشتی جوامع پیشرفته است. اگرچه امکان اصلاح منابع آلوده به فلزات سنگین با استفاده از تکنیکهای شیمیایی، فیزیکی و یا زیستی وجود دارد، اما این فرایندها معمولاً هزینهبر، وقتگیر و تخریبکننده هستند. این فلزات به دلیل صنعتی شدن جوامع بشری، بیش از حد در محیط زیست رها شده و باعث ایجاد یک نگرانی جهانی شدهاند. بسته به ماهیت و میزان فلز واردشده، فلزات سنگین میتوانند مشکلات جدی برای سلامت انسان به وجود آورند. خطرناکترین فلزات سنگین که انسان در معرض آنها قرار دارد عبارتاند از سرب، آلومینیم، آرسنیک، کادمیوم و جیوه. سرب میتواند باعث ایجاد سرطان در انسان شود. پسماندهای فلزات سنگین زیست تجزیهناپذیر بوده و میتوانند در بافتهای زنده تجمع یابند و درنتیجه باعث انواع بیماریها شوند. در دوران انقلاب صنعتی، مسمومیت شغلی با سرب امری طبیعی بوده است. کارگران معادن، سرب را از رنگپریدگی چهره تشخیص میدادند. با توجه به ویژگیهای غیر قابل تجزیه و تجمع سرب در محیط زیست، نظارت بر این یون فلزی امری اجتنابناپذیر و ضروری است. در سالهای اخیر آپتاسنسورهای مختلفی بر اساس عملکرد اسیدهای نوکلئوئیک با روشهای نوری و الکتروشیمیایی توسعه پیدا کردهاند. از بین حسگرهای نوری، روشهای فلورسانس و رنگسنجی به طورگستردهای به کار برده شدهاند. آپتاسنسورهای رنگسنجی دارای پتانسیل بالایی در شناسایی چشمی هستند و از مزایای آنها میتوان به سادگی، قیمت ارزان، کاربری راحت و بدون نیاز به ابزارهای پرهزینه و تخصصی اشاره کرد. اما حساسیت این روشها محدود است. با توجه به حساسیت و اختصاصیت بالای روشهای فلورسانس، این روشهای شناسایی در تشخیص یون سرب از اهمیت ویژهای برخوردار هستند. با وجود پیشرفتهای صورتگرفته در تکنیکهای سنجش یون سرب، برای تجزیه و تحلیل نمونههای پیچیده ازجمله نمونههای بیولوژیک مانند خون، ادرار و نمونههای آب، سیستمهایی که تجاریشده و در دسترس باشند، بسیار محدود میباشد. بنابراین، تلاشهای آینده پژوهش باید در جهت تهیه بیوسنسورهای قدرتمند و قابل اعتماد صورت گیرد. سادهسازی سنجشها و دستگاهها، سنتز آپتامرهای جدید با میل پیوندی بهتر برای یون سرب، بهکارگیری فنون بینرشتهای و فناوریهای جدید (مانند روشهای میکروفلوئیدی)، استفاده از نانوساختارهای جدید، بهینهسازی و تکرارپذیری در عملکرد آپتاسنسور در دمای اتاق، از جمله مباحثی است که باید مد نظر قرار گیرد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مقاله مروری میباشد و مطالب گفته شده برای آن کاربردی ندارد.
حامی مالی
این تحقیق هیچ گونه کمک مالی از سازمانهای تأمین مالی در بخشهای عمومی ، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
تحقیق و بررسی: تمامی نویسندگان؛ نگارش پیشنویس: نور محمد دانش، ابوالفضل دانش؛ مفهوم پردازی: ابوالفضل دانش؛ ویراستاری و نهاییسازی نوشته: کورش یوسفی حسن آباد، سید محمد تقدیسی؛ مدیریت پروژه: سید محمد تقدیسی.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
References