نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 مرکز تحقیقات سم شناسی، مؤسسه تحقیقات علوم پایه پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور، اهواز، ایران.
2 گروه شیمی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
3 گروه شیمی دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور، اهواز، ایران
چکیده
کلیدواژهها
مقدمه
سرطان یک مسئله عمده بهداشت عمومی در سراسر جهان است که پس از بیماریهای قلبیعروقی به عنوان دومین عامل مرگومیر در جهان شناخته میشود. به طوری که طبق آمارهای سازمان بهداشت جهانی برآورد شده است که تا سال 2025 سالانه بیش 19/3 میلیون مرگ در اثر بیماری سرطان رخ دهد [1]. از این رو توسعه عوامل جدید ضد سرطان با اثرات اختصاصی بالاتر و عوارض جانبی کمتر به عنوان یک هدف عمده در زمینه شیمی دارویی محسوب میشود [2].
هستههای فتالیمید و نفتالیمید واحدهای ساختاری مهمی هستند که در تعداد زیادی از آلکالوئیدهای طبیعی و مشتقات سنتزی یافت میشوند که این هستهها فعالیتهای بیولوژیکی مختلفی از جمله فعالیتهای ضد التهابی [3]، ضد باکتریایی [4 ,5]، ضد مالاریا [6]، ضد ویروسی [7]، مهار آنزیم هیستون داستیلاز [8, 9]، آنتی اکسیدانی [10] و ضد سرطان [11, 12 ,13 ,14, 15, 16] به این مشتقات میبخشد.
داروهای ضد سرطان اهداف مختلفی دارند که در این میان، DNA همچنان به عنوان هدف مهم برای شیمیدرمانی سرطان محسوب میشود. از این رو، داروهای برهمکنشکننده با DNA شامل عوامل الکیلهکننده، عوامل متصلشونده به شیار DNA و اینترکیلیتکننده با DNA در درمان سرطان کاربرد فراوانی پیدا کردهاند. یکی از این ترکیبات با توانایی بالقوه در اینترکیلیت شدن در DNA، مشتقات فتالیمید و نفتالیمید است. طراحی مواد ضد تومور بسیار مؤثر، از اهمیت قابل توجهی در شیمی دارویی برخوردار است. از این رو داروهای ضد سرطان نفتالیمید، محور مهمی در توسعه داروهای ضد سرطان را تشکیل میدهند. با کشف اولین ترکیب راهبر نفتالیمیدی، آمونافید (تصویر شماره 1)، توسط برانا و همکارانش [17, 18] تعداد زیادی از مشتقات نفتالیمید سنتز و فعالیت ضد توموری آنها بر انواع ردههای سلول سرطانی موش و انسان مورد بررسی قرار گرفت.
در این میان ترکیب آموفنامید نشان داد که یک عامل اینترکیلیتکننده بوده و موجب ایجاد شکستهای تکرشتهای، دورشتهای و همچنین ایجاد اتصالهای متقاطع بین DNA و پروتئین از طریق تداخل در عملکرد توپوایزومراز II میشود [19, 20, 21]. از آن پس، به اصلاح اسکلت نفتالیمید توجه زیادی صورت گرفت.
مشتقات اصلاحشده با سیستم چندحلقهای آروماتیک ترکیب شده و یک یا دو زنجیره جانبی ساده انعطافپذیر به آن اضافه شد. در سالهای اخیر، داروهای مختلف کونژوگه با اسید آمینه، مانند آنتراکینون گونژوگهشده با اسید آمینه و 9-هیدروکسی آلیپتیسینیوم گزارش شد (تصویر شماره 1)، که نتایج امیدوارکننده ای در این راه به دست آمد. این نکته بهخوبی تبیین شد که اسیدهای آمینه، مواد اولیه ضروری برای رشد سلول و سنتز پروتئین هستند که این اسید آمینهها میتوانند جذب مواد ضد تومور را بهبود بخشند. بنابراین، یک استراتژی محتمل برای افزایش جذب ترکیبات چربیدوست بیولوژیکی از غشای سلولی، ترکیب با اسیدهای آمینه بود. این مسئله سبب شد تا مشتقات مختلف نفتالیمید ترکیبشده با لوسین به عنوان زنجیره جانبی سنتز شوند. بررسی آزمایشهای اتصال DNA نشان داد که این مشتقات به عنوان مواد اینترکیلیتکننده با DNA عمل میکنند [1, 22, 23].
بنابراین با توجه به اهمیت مشتقات نفتالیمید و فتالیمید و با هدف توسعه عوامل ضد سرطان با خواص بیودارویی مطلوب و سمیت پایین، فعالیت سمیت سلولی 6 ترکیب از مشتقات فتالیمید و نفتالیمید سنتزشده که برخی از آنها دارای اسید آمینه ایزولوسین هستند، به روش MTT روی 3 رده سلولی سرطانی A549، SKOV3 و MCF-7 توسط تقوی و همکاران مورد بررسی قرار گرفت [24, 25, 26]. همچنین داکینگ مولکولی ترکیبات با DNA به منظور تعیین برهمکنشهای مهم و مؤثر ترکیبات با هدف، انجام شد.
روش بررسی
در این بخش میزان فعالیت سیتوتوکسیک ترکیبات با استفاده از تست MTT مورد بررسی قرار گرفت. همچنین مطالعات برهمکنش ترکیبات با DNA آنها به منظور بررسی دقیقتر مکانیسم احتمالی آنها به عنوان عوامل اینترکلیتکننده DNA، با استفاده از روشهای مدل سازی مولکولی انجام گرفت.
بررسی فعالیت سیتوتوکسیک به روش MTT
در این مطالعه تجربی سمیت سلولی 6 ترکیب فتالیمیدی و نفتالیمدی در برابر ردههای سلولی سرطان تخمدان (SKOV3)، سرطان ریه (A549) و سرطان پستان (MCF7) مورد بررسی قرار گرفت. در این روش، ابتدا سلولهای کشت دادهشده در فلاسک با استفاده از تریپسین از کف فلاسک جدا و پس از جمعآوری سلولها از کف فلاسک و شستوشو با محیط کشت (حاوی 10درصد آنتیبیوتیک و 10 درصد FBS)، تعداد سلولهای زنده با استفاده از لام نئوبار شمارش شد. سپس به هر چاهک پلیت 96تایی، تعداد 10 هزار سلول در حجم 100 میکرولیتر از محیط کشت اضافه شد. پس از گذشت 24 ساعت از کشت سلولها، محتویات مربوط به هر چاهک خارج و 100 میکرولیتر از ترکیبات با غلظتهای 1، 5، 10، 25، 50 و 100 میکرومولار به صورت 3 بار تکرار به چاهکها اضافه شد. به 3 چاهک نیز به عنوان کنترل منفی فقط محیط کشت اضافه شد. همچنین ترکیب دوکسوروبیسین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. سپس سلولها به مدت 72 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از اتمام زمان انکوباسیون محلول رویی هر چاهک برداشته و 100 میکرولیتر از محلول MTT 0/5 میلیگرم بر میلیلیتر به آن اضافه شد. به دنبال آن میکروپلیت به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس محلول رویی هر چاهک را برداشته و 100 میکرولیتر از محلول DMSO به هر چاهک افزوده شد. میکروپلیت به مدت 20 دقیقه روی شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه شیک شد. درنهایت جذب هر چاهک در طول موج 570 نانومتر نسبت به فیلتر مرجع 620 نانومتر ثبت شد.
میزان جذب نوری بهدستآمده بر اساس فرمول شماره 1 نسبت به چاهک بلانک نرمال شد و سپس درصد مهارکنندگی نسبت به جمعیت غلظت صفر با استفاده از فرمول شماره 1 محاسبه شد. آزمونهای آماری بر روی دادههای بهدستآمده، انجام گرفت.
1.
ODTreated= ODTest - ODBlank
درصد جمعیت سلولی=(ODTreated/ODConcentration zero(untreated)) × 100
بنابراین درصد مهارکنندگی طبق فرمول شماره 2 محاسبه میشود.
2.
%Inhibition=100-[OD treated⁄OD(untreated) ×100
برای تعیین IC50، ابتدا نمودار درصد مهارکنندگی بر حسب غلظت (6 غلظت مختلف، غلظتهای 1، 5، 10، 25، 50 و 100 میکرومولار) توسط نرمافزار Curve Expert نسخه 4/1 رسم شد. بدین وسیله غلظتی از ترکیب که در آن فقط 50 درصد سلولها زنده میمانند (Inhibitory Concentration 50: IC50)، به دست آمد.
داکینگ مولکولی
مطالعات داکینگ مولکولی این ترکیبات توسط نرمافزار Autodock نسخه 4/2 انجام شد. به منظور انجام این مطالعات داکینگ، بهترین ساختار کریستالوگرافی اشعه ایکس با کد 1LU5 از سایت www.rscb.org استخراج شد. سپس تمام تصحیحهای اسید آمینهای یا بازهای DNA با استفاده از نرمافزار MOE انجام شد. همچنین لیگاند همراه و مولکولهای آب حذف شد. به دنبال آن، اتمهای هیدروژن غیرقطبی در اتم کربن مربوطه ادغام شده و پارامترهای حلال پوشی ماکرومولکول و بارالکتریکی کُلمن با استفاده از نرمافزار Autodock نسخه 4/2 محاسبه شد و درنهایت فایل ماکرومولکول با فرمت pdbqt ذخیره شد. همچنین ساختار دوبعدی لیگاندها با استفاده از نرمافزار ChemBioDraw 2D ترسیم شد و سپس به محیط نرمافزار گرافیکی Hyperchem نسخه 8 منتقل شد. در این حالت بهینهسازی کانفورماسیون لیگاند از نظر انرژی با روش مولکولار مکانیک (MM+) و نیمهتجربی ( AM1یا PM3) انجام گرفت. این فایل به صورت pdb ذخیره شد. پس از بهینهسازی انرژی لیگاند، بارالکتریکی گَستیگِر (بارهای الکتریکی اتم که به صورت تجربی محاسبه میشود) و تعداد درجات آزادی زوایای پیچشی لیگاند با استفاده از نرمافزار AutoDock محاسبه شد. درنهایت فایل لیگاند به صورت pdbqt ذخیره شد.
پس از آمادهسازی فایلهای ورودی مورد نیاز داکینگ (ماکرومولکول، لیگاند و نقشه اتصال)، مطالعات داکینگ به منظور مدلسازی برهمکنشهای لیگاند -DNA، با استفاده از الگوریتمی تحت عنوان ژنتیک لامارکین انجام شد [27].
سپس بر اساس حجم مولکولی لیگاندهای طراحیشده، شبکهای با ابعاد 64×68×116 آنگستروم در راستای محورهای سهگانه مختصات و فاصله نقاط شبکهای 0/375 آنگستروم (یکچهارم طول پیوند ساده کربن کربن) که دربرگیرنده جایگاه فعال DNA بود، در نظر گرفته شد. مختصات مرکز جعبه نسبت به محورهای x ، y و z به ترتیب 17/088، 21/079 و 9/188 هستند.
اعتبارسنجی فرایند داکینگ
برای معتبرسازی محاسبات داکینگ از روش اختلاف مجذور مربع میانگین استفاده شده است. در این روش اختلاف مجذور مربع میانگین مختصات اتمهای مربوط به کنفورماسیون لیگاند اصلی استخراجشده از ساختارکریستالوگرافی و بالاترین کانفورماسیون محاسبهشده این لیگاند توسط محاسبات داکینگ مولکولی به عنوان معیاری از صحت بهترین کانفورمر پیشبینیشده توسط نرمافزار در نظر گرفته شد. خطای جذر میانگین مربعات یا انحراف جذر میانگین مربعات، تفاوت میان مقدار پیشبینیشده توسط مدل یا برآوردگر آماری و مقدار واقعی است. RMSD ابزار خوبی برای مقایسه خطاهای پیشبینی توسط یک مجموعه داده است و برای مقایسه چند مجموعه داده کاربرد ندارد. آنالیز خوشهبندی کنفورماسیونهای نتایج داکینگ بر این اساس صورت پذیرفت که کانفورماسیونهای مشابه (قرارگرفته در یک خوشه) حداکثر آستانه اختلاف مجذور مربع میانگین (RMSD) معادل 2 آنگستروم داشته باشند.
یافتهها
ارزیابی فعالیت سیتوتوکسیک ترکیبات
پس از محاسبه درصد مهارکنندگی ترکیبات بر روی 3 رده سرطانی مذکور در غلظتهای مختلف، فعالیت ضد سرطانی این ترکیبات با استفاده از نرمافزار Curve Expert نسخه 4/1 به صورت IC50 محاسبه و در جدول شماره 1 گزارش شد.
داکینگ مولکولی
برهمکنش ترکیبات با DNA (1LU5) توسط داکینگ مولکولی مورد بررسی قرار گرفت و نتایج انرژی داکینگ در جدول شماره 2 آورده شده است.
برای برهمکنش مدلهای پیشبینیشده توسط داکینگ مولکولی با جایگاه فعال DNA، از نقشه دوبعدی و سهبعدی اتصال ترکیبات به DNA استفاده شد که در این میان، نقشه اتصال ترکیب C1 با بالاترین انرژی داکینگ مولکولی در تصویر شماره 2 آورده شده است.
بحث
با توجه به نتایج بهدست آمده در جدول شماره 1، بیشترین فعالیت سیتوتوکسیک بر روی رده سرطانی پستان (MCF-7)، مشاهده شد که در بین این ترکیبات، ترکیب C1 با IC50=1.7 µΜ بالاترین اثرات سمیت سلولی را از خود نشان داد. هرچند مقدار IC50 آن نسبت به DOX بیشتر است، ولی آنالیز آماری به روش آنووای یکطرفه نشان داد که این تفاوت معنادار نبود. به دنبال آن، ترکیبهای C2 و C3 با IC50 معادل به ترتیب 44/3 و 65/5 میکرومولار اثرات سمیت سلولی خوبی از خود نشان دادند. به طور کلی ترتیب اثرات سمیت سلولی ترکیبات بر روی این رده به شرح فرمول شماره 3 هستند.
3.
MCF-7: DOX> C1 > C3> C5 > C3 > C4, C6
علاوه بر این، در ارزیابی اثرات سیتوتوکسیک بر روی رده سرطانی ریه (A549)، در ترکیب C1 بیشترین فعالیت سیتوتوکسیک مشاهده شد. این ترکیب دارای IC50= 6.2 µΜ است. بعد از ترکیب C1، ترکیبهای C2 و C3 با IC50 به ترتیب 59/0 و 76/1 میکرومولار اثرات سمیت سلولی کمتری از خود نشان دادند. ترتیب قدرت ترکیبات بر روی این رده به شرح فرمول شماره 4 است.
4.
A549: DOX> C1 > C2> C3 > C5> C4, C6
همچنین در ارزیابی اثرات سیتوتوکسیک بر روی رده سرطانی تخمدان (SKOV3)، بیشترین فعالیت سیتوتوکسیک مشاهدهشده در بین این ترکیبات، مربوط به ترکیب C1 است. این ترکیب دارای IC50=9.5 µΜ است. ترکیب C3 با IC50 معادل 71/8 میکرومولار فعالیت سیتوتوکسیک ضعیفتری نسبت به ترکیب C1 بر روی این رده از خود نشان داد.
ترتیب قدرت ترکیبات بر روی این رده به شرح ذیل فرمول شماره 5 است.
5.
SKOV3: DOX> C1 > C3> C2> C5> C4, C6
به طور کلی ترکیب C1 نسبت به بقیه ترکیبات بر روی هر 3 رده سرطانی موردبررسی، از نظر فعالیت سیتوتوکسیک اثرات بهتری از خود نشان داده است و به عنوان قویترین ترکیب مجموعه عمل کرده است.
علاوه بر این، مقایسه نتایج بهدستآمده در این مطالعه با نتایج حاصل از مطالعات پیشین [23، 28] نشان میدهد که ترکیب C1 نسبت به ترکیبات مورد بررسی در آن مطالعات اثرات بهتری از خود نشان داده است. در یکی از این مطالعات که یکسری از ترکیبات نفتالیمیدی کونژوگه با لوسین سنتز شده بود و فعالیت ضد سرطانی آنها در برابر چندین روده سلولی از جمله MCF-7 و A549 مورد بررسی قرار گرفته بود [23]، بهترین ترکیب این مطالعه، 7b، بر روی این دو رده، IC50 به ترتیب معادل 15/02 و 25/08 میکرومولار داشته که این مقادیر نسبت به مقادیر حاصل از ترکیب C1 بیشتر است.
بررسی رابطه ساختار فعالیت ترکیبات
بررسیهای اولیه نشان میدهد که ترکیبات نفتالیمید (C1-C2) اثرات قویتری نسبت به ترکیبات فتالیمید (C3-C6) نشان میدهند. همچنین به طور کلی، این ترکیبات بر روی رده سلولی MCF-7 اثرات بهتری نسبت به دو رده دیگر (A549, SKOV3) داشتند. قویترین ترکیب در بین هر دو دسته مشتقات، ترکیب C1 است که به دسته ترکیبات نفتالیمیدی تعلق دارد که این اثرات بهتر را میتوان به داشتن بخش اسیدآمینهای ایزولوسین نسبت داد، چراکه این بخش با افرایش امکان جذب در سلولهای سرطانی، منجر به افزایش اثرات ضد سرطانی شده است [23]. علاوه بر این، مقایسه مشتقات فتالیمید و نفتالیمید نشان میدهد که ترکیباتC1 و C3, C5 دارای بخش کربوکسیل، اثرات بهتری نسبت به سه ترکیب C6 و C2 ،C4 که دارای بخش 5-آمیدوایزو فتالیک اسید است، ایجاد میکند. این نتایج میتواند به این دلیل باشد که ترکیبات C1 و C3 ،C5 دارای فقط یک گروه کربوکسیل هستند. در حالی که ترکیبات C6 و C2 ،C4 دارای دو گروه کربوکسیل هستند. بخش کربوکسیل به دلیل اینکه میتواند یونیده شود میزان جذب ترکیب را کاهش میدهد.
داکینگ مولکولی
همانطور که در جدول شماره 2 مشاهده میشود، ترکیب C1 دارای بهترین (منفیترین) انرژی اتصال به DNA است. این ترکیب نسبت به سایر ترکیبات در اتصال به DNA عملکرد بهتری داشته است. ترتیب انرژی داکینگ ترکیبات بر روی ساختار DNA به شرح فرمول شماره 6 است.
6.
DNA (1LU5): C1 > C3 > C5 > C2 > C6 > C4
بررسی الگوهای برهمکنش ترکیبات DNA
بعد از مشخص شدن جایگاه هر ترکیب در رتبهبندی داکینگ، فاکتور مهمی که مورد بررسی قرار گرفت نحوه برهمکنش ترکیبات با بازهای کلیدی جایگاه فعال DNA است، زیرا در حین بررسی نتایج داکینگ ترکیبات با رسپتور، تنها نمیتوان با تکیه بر دادههای کمی داکینگ غربالگری را انجام داد، بلکه بایستی نحوه برهمکنش برترین کانفورمر پیشبینیشده توسط داکینگ با جایگاه فعال رسپتور مورد ارزیابی قرار گیرد. چه بسا لیگاندی انرژی آزاد پیوند شدن بزرگ (منفی) داشته باشد، اما به موقعیتی به غیر از جایگاه فعال DNA یا آنزیم متصل شود و یا حتی با وجود اتصال به جایگاه فعال، برهمکنشهای کلیدی با بازها و یا اسیدهای آمینهای که در مدلهای فارماکوفوری ارائه شدهاند را نداشته باشد.
در همین راستا و برای ارزیابی نحوه برهمکنش مدلهای پیشبینیشده توسط داکینگ با جایگاه فعال DNA، از نقشه دوبعدی و سهبعدی اتصال ترکیبات به DNA استفاده شد. این نقشهها با استفاده از نرمافزارهای AutoDock Tools و MOE (2014) ایجاد شدهاند.
همان طور که در تصویر شماره 2 نشان داده شده است، ترکیب C1 در شیارکوچک DNA، قرار گرفته و از طریق باز سیتوزین شماره 3 با کربونیل حلقه فتالیمیدی پیوند هیدروژنی برقرار میکند. همچنین از طریق OH گروه کربوکسیل بخش اسید آمینه ایزولوسین با باز گوانین شماره 12 پیوند هیدروژنی ایجاد میکند.
اعتبارسنجی داکینگ مولکولی
مطالعات داکینگ مولکولی در صورتی موفقیتآمیز خواهد بود که روشهای بهکاررفته در آن اعتبارسنجی شده باشند. هدف از اعتبارسنجی فرایند داکینگ این است که منابع نرمافزاری و روش انتخابشده تا چه میزان توانایی تمییز دادن بین ترکیبات فعال و غیرفعال را دارند.
روشهای مختلفی برای اعتبارسنجی فرایند داکینگ و تابع امتیازدهی آن وجود دارد [2]. یک روش متداول، بررسی کانفورماسیون پیشبینیشده در فرایند داکینگ است. در این روش یک ترکیب با ساختار و جهتگیری مشخص در جایگاه فعال آنزیم (معمولاً ساختار کریستالوگرافی دارای لیگاند)، با استفاده از نرمافزار داکینگ دوباره در جایگاه فعال آنزیم داک میشود. نرمافزاری که کانفورمر پیشبینیشده توسط آن نسبت به ساختار کریستالوگرافی دارای RMSD کمتری باشد (معمولاً بین 1/5 تا 2 آنگستروم بسته به اندازه لیگاند) فرایند داکینگ را با موفقیت بیشتری انجام داده است [29]. بدین منظور داکینگ لیگاند کوکریستاله با DNA طبق پارامترهای اعمالشده بر ترکیبات منتخب، نیز انجام شد و این ترکیب در ساختار DNA در جایگاهی بسیار یکسان با حالت کوکریستاله خود قرار گرفت و RMSD بهدستآمده 1/56 آنگستروم (کمتر از 2 آنگستروم) بوده است.
نتیجهگیری
در این مطالعه تجربی 6 ترکیب فتالیمدی و نفتالیمیدی با اثرات بالقوه ضد سرطانی مورد بررسی قرار گرفت که نتایج آزمایشگاهی تأییدکننده این مطلب است که این ترکیبات اثرات بالقوه ضد سرطانی از خود نشان میدهند که در میان این ترکیبات، ترکیبC1 با پایینترین مقادیر IC50، توانایی این را دارد که در مسیر توسعه ترکیبات ضد سرطان به عنوان ترکیب راهبر انتخاب شده و مورد بررسیهای بیشتر قرار گیرد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه مورد تأیید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز قرار گرفته است (کد: 1396.470IR.AJUMS.REC.). این مطالعه در حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز با کد B-9653 به تصویب رسیده است.
حامی مالی
مقاله حاضر بخشی از رسالهی دکترای حرفهای داروسازی عمومی نویسنده اول در مرکز تحقیقات سم شناسی، مؤسسه تحقیقات علوم پایه پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور، اهواز است. دانشگاه علومپزشکی جندیشاپور اهواز حامی مالی این پژوهش بوده است.
مشارکت نویسندگان
ویراستاری، نهاییسازی نوشته، تحقیق و بررسی: ایوب مجدمی؛ انجام تستهای بیولوژیکی: نگین آهنج؛ نگارش پیشنویس: مهدی تقوی.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از دانشگاه علومپزشکی جندیشاپور اهواز که بودجه لازم برای این کار را فراهم کرد و همچنین مرکز سمشناسی را که در اختیار محققان گذاشت، تشکر و قدردانی میکنند.
Refrences