مطالعه اثرات ضدسرطانی فراکشنهای پروتئینی جد اشده از سم مار شا خدار ایرانی و بررسی خواص ضدباکتریایی آ نها در شرایط آزمایشگاهی

Introduction
One of the serious problems of the medical community in the treatment of infectious diseases caused by bacterial agents is the resistance of many bacteria to common antibiotics. These bacteria are becoming a serious clinical problem worldwide. This has caused pharmaceutical companies to try to discover new antibacterial drugs or optimize old antibiotics in order to produce new and effective drugs. Today, the venom of poisonous animals has attracted the attention of many researchers as one of the important natural resources for the isolation and identification of molecules with antimicrobial properties, and has received great success. Reports show that despite the contamination of the mouth and teeth of poisonous snakes with a wide range of pathogenic bacteria, a small prevalence of bacterial infection at the bite site is observed in snakebite victims. These observations have led the researchers to the fact that there are antibacterial compounds in snake venom. Studies have shown that the molecular compounds, especially the proteins, in the venom of snakes from Viperidae family have a great diversity. Serine protease, metalloproteinase, phospholipase A2 (PLA2), C-type lectin, acetylcholinesterase, L-amino acid oxidase, and detergents are among the important compounds in the venom of these vipers. Many of these compounds have antimicrobial properties. In this study, for the first time, the antibacterial effects of the protein fractions isolated from the crude venom of the Persian horned snake (Pseudocerastes persicus) and the anticancer effects of the fractions with antibacterial properties are investigated.
Methods
In order to prepare venom from the snake, following the safety precautions, the venom of the snake was injected through the poisonous tooth (fang) into the venom collection jar. Non-pathogenic gram-positive bacillus, gram-negative Escherichia coli, and pathogenic gram-positive Staphylococcus aureus were obtained from the Persian Type Culture Collection (PTCC) and liver cancer cells (HepG2, C158) were obtained from the cell bank of Pasteur Institute of Tehran. 
The antibacterial effect of fractions was assessed using MTT assay. This test is a colorimetric method based on the reduction and breaking of yellow tetrazolium crystals by the enzyme succinate dehydrogenase in the cytoplasm and finally the formation of insoluble blue crystals. Based on this method, the survival rate of bacteria was calculated after contact with different concentrations of venom. The antibacterial effect of the fractions was assessed using the minimum inhibitory concentration (MIC) assay. Based on this method, the inhibition rate due to the effect of venom and standard antibiotics was calculated.
The cytotoxicity of the fractions was assessed using the MTT reduction assay described by Dezanian et al and the neutral red uptake (NRU) assay. the MTT reduction test was repeated 3 times and 3 wells were considered for each concentration. The percentage of cell viability after contact with different concentrations of venom was calculated. The procedure of NRU assay was similar to that of MTT assay; however, after incubating the cells adjacent to toxic solution for 23 hours, instead of MTT solution, one microliter of neutral red solution (5 mg/ml) was added to each well. Then, the inhibition rate caused by different concentrations of venom on cell growth was calculated.
The apoptosis induction by fractions was assessed using alkaline comet assay. It is one of the best tests for assessing DNA fragmentation in cells. For each sample, the images of the DNA of at least 100 cells were taken and the results were statistically analyzed in GraphPad software.
Results
In examining the electrophoresis pattern and chromatography of crude venom, the molecular weight of the bands was determined using the standard protein diagram. The results of SDS-PAGE (15% gel) showed the presence of 10 protein bands. Results of MTT assay showed that fractions 3, 4, 7 and 9 had no inhibitory effect on Escherichia coli bacteria, while fractions 5, 6, 8 and 10 showed antibacterial effects. 
The results of assessing the inhibitory effects (MIC assay) of the isolated fractions with a concentration of 20 μg/ml on the growth of bacteria showed that fractions 3 and 9 had no effect on Escherichia coli bacteria, while fractions 4, 5, 6, 7, 8 and 10 had an inhibitory effect.
Results of assessing the cytotoxicity effects (MTT redaction assay) of fractions 4 and 8 isolated from crude venom on the growth of liver cancer cells in two concentrations of 20 and 40 μg/ml showed that the cell viability under the influence of fraction 4 in the two mentioned concentrations was 51.55 and 50.62%, respectively compared to the control. The cell viability increased after contact with fraction 8 in the two concentrations and reached 82.29 and 74.81%, respectively. 
The results of NRU assay for the fractions 4 and 8 showed that the cell death rate caused by fraction 4 in two concentrations was 35.19 and 50.93% respectively, while under the influence of fraction 8, it was 82.29 and 74.81%, respectively. They were significant compared to controls. 
The results of alkaline comet assay showed that fraction 4 in two mentioned concentrations caused apoptosis in liver cancer cells by 39.31 and 38.97%, and fraction 8 in the two concentrations caused apoptosis by 24.73 and 25.34%, respectively. They were significant compared to controls.
Conclusion
The venom of poisonous snakes includes molecules with different biological activities, which can be of great interest in medical and biological research. Since the proteins and peptides in snake venom have different molecular sizes and biochemical properties, proteome analysis can be very important in identifying and isolating these compounds. The results of protein analysis showed that only 8 fractions out of 11 fractions had proteins. It was found that the crude poison of Persian horned snake had antibacterial properties. The cytotoxicity effects of selected fractions (with antibacterial properties) on liver cancer cells (HepG2) were also investigated. The results showed that fraction 8 induced the least toxicity in the cells. This introduces this fraction as a suitable candidate for isolating effective molecules with antibacterial properties that have the least side effects on human cells. Fraction No. 4 also induced the greatest effect on cancer cells; therefore, this fraction can be a suitable candidate for the discovery of anti-cancer drugs.

Ethical Considerations
Compliance with ethical guidelines
Considering that in this study, living beings such as animals, models, etc. were not used; Therefore, no action was taken to obtain the code of ethics.

Funding
This research did not receive any specific grant from funding agencies in the public, commercial, or not-for-profit sectors.

Authors' contributions
All authors contributed equally in preparing all parts of the research.

Conflicts of interest
The authors declared no conflict of interest.

Acknowledgements
We are grateful for the sincere cooperation of the members of the Department of Biological Sciences of Imam Hossein University (AS) who helped us in conducting our research.

مقدمه
یکی از مشکلات جدی جامعه پزشکی در درمان بیماری‌های عفونی ناشی از عوامل باکتریایی، مقاوم شدن بسیاری از باکتری‌ها به آنتی­‌بیوتیک­‌های رایج است. این باکتری‌ها در حال تبدیل شدن به یک مشکل بالینی جدی در سراسر جهان هستند [1].  
این امر سبب تلاش مؤسسات داروسازی جهت کشف داروهای ضد‌باکتری جدید یا بهینه‌سازی آنتی‌بیوتیک­‌های قدیمی جهت دست‌یابی به تولید دارو‌­های جدید و مؤثر شده است. امروزه زهر جانوران سمی به‌عنوان یکی از منابع طبیعی مهم جهت جداسازی و شناسایی مولکول‌های با خواص ضد‌میکروبی مورد توجه بسیاری از محققین قرار گرفته و از اقبال زیادی برخوردار شده است.
گزارش‌ها نشان می‌­دهد با وجود آلودگی‌­های دهان و دندان نیش مار­های سمی به طیف گسترده‌­ای از باکتری‌های بیماری‌زا، شیوع کمی از عفونت باکتریایی در محل گزیدگی در مصدومین ناشی از مارگزیدگی مشاهده می­‌شود [2]. این مشاهدات، محققین را به این موضوع رهنمون کرد که در سم مار ترکیبات ضد‌باکتری وجود دارد [3]. 
اولین گزارش در مورد فعالیت‌های ضد‌باکتری در سم مارهای خانواده الاپیده و ویپریده به‌ترتیب در سال‌های 1948 و 1968 منتشر شد [4]‌. اسکارنز نیز در سال 1970 برای نخستین بار فعالیت ضد‌میکروبی برخی از آنزیم‌­های موجود در سم مار را گزارش کرد [5]. مطالعات زی و همکاران در سال 2000 به جداسازی پپتیدهایی از سم Naja Atra منجر شد که در شرایط آزمایشگاهی از رشد باکتری‌های مقاوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جلوگیری کردند و فعالیت مهاری از خود نشان دادند [6]. بررسی‌ها نشان می‌دهد ترکیبات مولکولی به‌ویژه پروتئین‌های موجود در سم افعی‌های خانواده ویپریده از تنوع زیادی برخوردار است. از ترکیبات مهم سموم این افعی‌ها می‌توان پروتئاز سرین، متالوپروتئیناز، فسفولیپاز A2(PLA2)، لکتین نوع C-، استیل کولینستراز، ال‌ـ‌آمینواکسیداز و دترجنت‌ها را نام برد [7]. تحقیقات اخیر نشان داد بسیاری از این ترکیبات خواص ضدمیکروبی دارند [1، ‌8، 9]. 
در این تحقیق، برای اولین بار اثرات ضد‌باکتریایی فراکشن‌های پروتئینی جدا‌شده از سم خام مار شاخ‌دار ایرانی و اثرات ضد‌سرطانی فراکشن‌­های دارای خواص آنتی‌باکتریال مطالعه شد. 
روش بررسی
تهیه سم
جهت تهیه سم مار، با رعایت نکات ایمنی دندان سمی یا فنگ مار مستقیماً داخل شیشه جمع‌آوری سم قرار داده شد و با فشاری مختصر به غده سمی، سم به داخل شیشه تزریق شد. محلول سمی پس از لیوفیلیز شدن تا زمان استفاده در آزمایش‌ها در دمای منهای 20 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
میکروارگانیسم‌ها و رده سلولی مورد استفاده
 باکتری غیر‌بیماری‌زای گرم مثبت باسیلوس سوبتیلیس، باکتری گرم منفی اشرشیاکلی و سوش گرم مثبت بیماری‌زا استافیلوکوکوس اورئوس از مرکز کلکسیون قارچ‌­ها و باکتری‌های صنعتی ایران و سلول‌های سرطان کبد از بانک سلولی انستیتو پاستور تهران تهیه شد.
مطالعه الگوی الکتروفورزیس زهر خام با استفاده از روش سدیم دودسیل سولفات- پلی آکریل آمید
 برای مطالعه الگوی الکتروفورزیس زهر خام افعی شاخ‌دار ایرانی از ژل 12-15 درصد استفاده شد [10]. به هر چاهک 5-10 میکرولیتر محلول سمی (دارای 15 تا 20 میکروگرم پروتئین) دناتوره‌شده با حجم مناسب از بافر نمونه تزریق شد. جهت تخمین وزن مولکولی باندهای پروتئینی از پروتئین استاندارد استفاده شد. 
الکتروفورز در ابتدا با ولتاژ 50 ولت شروع شد و پس از عبور رنگ ردیابی از ژل متراکم‌کننده، الکتروفورزیس با ولتاژ 150 ولت و تا رسیدن رنگ ردیابی به حدود 1 سانتی‌متری از انتهای کاست ژل ادامه یافت. پس از رنگ‌آمیزی ژل با رنگ کوماسی‌بلو و حذف رنگ اضافی از سطح ژل به وسیله محلول رنگ ­بر وزن مولکولی تخمینی باند­های پروتئینی سم خام تعیین شد. 
جداسازی فراکشن­‌های سم خام با استفاده از کروماتوگرافی مایع فاز معکوس 
فراکشن‌های زهر خام مار شاخ‌دار ایرانی با استفاده از R-HPLC تهیه و با آشکارسازUV  (جذب 220 نانومتر)، ستون C18 [250mm×21, 2mm,12µm (59185)18-SUPELCOSIC TM Pcc] و برنامه خطی گرادیان‌ [بافرA  ( استونیتریل 20 درصد حاوی 0/1 درصد تری فلورو استیک اسید)، بافر B (‌استونیتریل 80 درصد حاوی 0/1 درصد تری فلورو استیک اسید)] و زمان 70 دقیقه‌ای جداسازی شد. در روش فاز معکوس، از یک فاز متحرک قطبی و فاز ساکن غیر‌قطبی استفاده می‌شود و جدا‌سازی مواد با استفاده از ویژگی هیدروفوبیسیتی انجام می شود [11]. 
برای جداسازی فراکشن­‌های زهر خام، 40 میلی‌گرم پودر خشک‌شده آن در 20 میلی‌لیتر از بافر (آب حاوی 0/01 درصد تری فلورو استیک اسید دارای 5 درصد استونیتریل) حل و به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتی­‌گراد قرار داده شد. مواد نامحلول پس از سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه با سرعت 10 هزار دور در دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد از سوسپانسیون جدا شد. محلول رویی جهت تهیه الگوی کروماتوگرافی و جداسازی فراکشن‌ها توسط روماتوگرافی مایع با کارایی بالا استفاده شد. 
فراکشن‌های متناظر با هر پیک در شیشه‌های کاملاً تمیز و عاری از هر‌گونه آلودگی به پروتئین به‌صورت دستی جمع‌آوری و پس از لیوفیلیز کردن، در دمای 80- نگهداری شد. زمان خروج هر پیک برای هر‌کدام از پیک‌ها ثبت شد.
پروتئین سنجی
جهت انجام تست­‌های ضد­باکتریایی و تست‌­های سمیت سلولی مقداری از سم لیوفیلیز‌شده در آب دو بار تقطیر استریل حل شد. میزان پروتئین موجود در محلول سمی با روش برادفورد در سال 1976 تعیین و فراکشن‌­های فاقد پروتئین از بررسی‌های بعدی حذف شدند.
بررسی خواص ضد­باکتریایی
محیط کشت و آنتی‌بیوتیک: جهت کشت باکتری از محیط کشت مایع و جامد مولار هینتون شرکت کیولب کانادا استفاده شد. جهت مقایسه اثر سم با آنتی‌بیوتیک استاندارد از تتراسایکلین (Sigma, USA) با غلظت 50 میکروگرم بر میلی‌گرم استفاده شد.
بررسی میزان اثر ضد‌باکتریایی فراکشن‌ها با استفاده از MTT Assay
تست MTT یک روش رنگ‌سنجی است که براساس احیا شدن و شکسته شدن کریستال­‌های زردرنگ تترازولیوم به وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز موجود در سیتوپلاسم و درنهایت، تشکیل کریستال­‌های آبی‌رنگ نامحلول انجام می‌شود. این کریستال­‌ها با اضافه کردن DMSO به شکل محلول درمی‌آیند [12]. باکتری موردنظر در محیط مولر هینتون براث کشت داده شد و پس از 5 ساعت، هنگامی که به جذبی معادل نیم مک‌فارلند (در طول موج 600 نانومتر دارای جذبی معادل 0/08 تا 0/1 است) رسید [13]، میزان 5 میکرولیتر در هر چاهک پلیت 96 خانه استریل کشت شد. فراکشن­‌ها با غلظت­ 20 میکروگرم در میلی‌لیتر به چاهک‌­ها اضافه و حجم نهایی هر چاهک با استفاده از محیط کشت مایع (مولر هینتون براث) به 100 میکرولیتر رسانده شد. 
در این آزمایش از تتراسایکلین (50 میکروگرم در میلی‌­لیتر) به‌عنوان کنترل مثبت، سوسپانسیون باکتری و محیط کشت به عنوان کنترل منفی و از محیط کشت فاقد باکتری به‌عنوان بلانک استفاده شد. پلیت به مدت 23 ساعت درون انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی­‌گراد انکوبه شد. سپس به تمام چاهک‌ها 5 میکرولیتر  MTT (غلظت 5 میکروگرم در میلی‌­لیتر) اضافه‌ شد. پلیت به مدت 1 ساعت در شرایط تاریکی در دمای 37 درجه سانتی‌­گراد قرار داده شد. 
در ادامه 100 میکرولیتر از DMSO به هر چاهک اضافه شد. پس از 2 ساعت انکوبه کردن در شرایط تاریکی، جذب نوری چاهک‌­ها در طول موج 595 نانومتر با استفاده از دستگاه پلیت ریدر (Biotek, USA) اندازه‌گیری شد. آزمایش فوق 3 بار انجام و در هر مرتبه برای هر غلظت 3 چاهک (3 بار تکرار) درنظر گرفته شد. درصد زنده ماندن باکتری‌ها بعد از تماس با غلظت‌های مختلف سم با استفاده از فرمول شماره 1 محاسبه شد [13].

بررسی میزان اثر ضد‌باکتریایی فراکشن‌ها با استفاده از روش حداقل غلظت مهاری 
در این تحقیق از روش حداقل غلظت مهاری به منظور تعیین اثرات مهاری سم خام بر باکتری‌ها استفاده شد. مراحل انجام تست حداقل غلظت مهاری [14] مشابه تست MTT Assay بوده، اما پس از انکوبه کردن باکتری با غلظت‌های مختلف سم در دمای 37 درجه سانتی‌‌گراد به مدت 24 ساعت و بدون اضافه کردن هیچ‌گونه ماده نشانگر، جذب نوری چاهک­‌ها در طول موج 605 نانومتر با استفاده از دستگاه خوانش پلیت (Biotek, USA) اندازه‌گیری شد. این آزمایش نیز 3 بار تکرار و در هر بار برای هر غلظت 3 چاهک (3 بار تکرار) درنظر گرفته شد. درصد مهاری ناشی از تأثیر سم و آنتی‌بیوتیک استاندارد با استفاده از فرمول شماره 2 محاسبه شد [14].

بررسی 
خواص ضد‌سرطانی فراکشن‌ها
کشت سلول
جهت از بین بردن آلودگی‌های احتمالی در محلول سمی مورد نیاز تست‌­های سلولی، 1 درصد آنتی‌­بیوتیک‌ـ‌آنتی­‌مایکوتیک (Invitrogen, USA) اضافه و پس از یک شب نگهداری در دمای 4 درجه سانتی­‌گراد در آزمایش‌ها استفاده شد. برای کشت سلول HepG2 ‌از محیط کشت DMEM-F12 (Gibco, USA) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی تهیه‌شده از شرکت (Gibco, USA) استفاده شد. این سلول­‌ها‌ در فلاسک‌هایی با حجم‌ 25-50 میلی‌لیتر مکعب کشت داده و در دمای 37 درجه سانتی‌­گراد و 5 درصد دی‌اکسید­کربن نگهداری شدند. هر 2-3 روز یک‌بار محیط کشت قدیمی تعویض و پس از فراهم شدن جمعیت سلولی مورد نیاز برای هر آزمایش‌ با استفاده از Trypsin-EDTA تهیه‌شده از شرکت (Sigma-Aldrich, USA) از فلاسک جدا و پس از شمارش با استفاده از لام نئوبار به کار گرفته شدند.
بررسی میزان سمیت سلولی فراکشن‌ها با روش MTT Redaction
این روش، مطابق روش انجام‌شده توسط دزیانیان و همکاران انجام شد [15]. به منظور انجام این تست تعداد 104×2 در هر چاهک پلیت 96 خانه­‌ای حاوی 100 میکرولیتر کشت فاقد سرم کشت داده شد. پس از یک شب انکوبه کردن در شرایط 5 درصد دی اکسیدکربن، رطوبت حدود 80 درصد و دمای 37 درجه سانتی‌گراد محیط کشت قدیمی تخلیه و محیط کشت جدید فاقد سرم حاوی غلظت‌های مختلف 20 و 40 میکروگرم در میلی‌لیتر از فراکشن‌­های (دارای خواص ضد­باکتریایی) به چاهک‌‌ها اضافه شد. پلیت حاوی پس از مجاورت دادن با سلول سم، به مدت 23 ساعت در شرایط فوق‌الذکر انکوبه شد. پس از آن به هر چاهک 5 میکرولیتر محلول MTT (غلظت 5 میلی‌گرم در میلی­‌لیتر) اضافه شد. 
پس از تشکیل کریستال آبی تیره (فورمازون) محتویات هر چاهک خارج شد و پس از شست‌وشو با PBS، 100 میکرولیتر DMSO به آن اضافه شد. در این تست از محیط کشت به‌عنوان آزمایش و از محیط کشت حاوی سلول به‌عنوان کنترل استفاده شد. جذب نوری چاهک‌­ها در طول موج 570 نانومتر با استفاده از دستگاه پلیت ریدر (Biotek, USA) اندازه‌گیری شد. این آزمایش 3 بار تکرار و در هر بار برای هر غلظت 3 چاهک (3 بار تکرار) درنظر گرفته شد. درصد زنده ماندن سلول پس از تماس با غلظت‌های مختلف سم به کمک فرمول شماره 3 محاسبه شد [14].

بررسی سمیت سلولی فراکشن‌ها با روش رنگ‌سنجی قرمز خنثی 
مراحل انجام تست رنگ‌سنجی قرمز خنثی [16] مشابه تست MTT Assay بود، اما پس از انکوبه کردن سلول مجاورت داده‌شده با محلول سمی به مدت 23 ساعت، به جای محلول MTT، یک میکرولیتر از محلول قرمز خنثی (غلظت 5 میلی‌‌گرم در میلی­‌لیتر) به هر چاهک اضافه شد. سپس پلیت تا هنگام تشکیل کریستال قرمز (اتصال قرمز خنثی با سطح لیزوزوم سلول) تحت شرایط تاریکی و دمای 37 درجه سانتی‌­گراد، 5 درصد دی‌اکسید‌کربن و رطوبت حدود 80 درصد انکوبه شد. 
پس از آن محلول موجود در هر چاهک تخلیه و پس از 2 بار شست‌وشوی هر چاهک با PBS‌، 100 میکرولیتر بافر فیکس‌کننده (فرمالدهید 37 درصد، ﮐﻠﺮﯾﺪ ﮐﻠﺴﯿﻢ 10 درصد) به آن اضافه شد. پس از 1 دقیقه، این بافر تخلیه و 100 میکرولیتر از بافر حل‌کننده (اسید استیک 0/5 درصد) به آن اضافه شد. در ادامه، پلیت به مدت 20 دقیقه روی شیکر، در شرایط تاریکی و در دمای آزمایشگاه انکوبه و جذب نوری چاهک‌­ها در طول موج 540 نانومتر با استفاده از دستگاه پلیت ریدر (Biotek, USA) اندازه‌گیری شد. 
این آزمایش 3 بار تکرار و در هر بار برای هر غلظت 3 چاهک (3 بار تکرار) درنظر گرفته شد. درصد مهاری ناشی از غلظت‌های مختلف سم بر رشد سلول با استفاده از فرمول شماره 4 محاسبه شد.

بررسی القای آپوپتوزیس توسط فراکشن‌ها با استفاده از تست کامت قلیایی 
کامت قلیایی یکی از بهترین تست‌های بررسی DNA Fragmentation در سلول است [17]. برای انجام این آزمایش، ابتدا در هر چاهک پلیت 24 خانه‌ای استریل حاوی 300 میکرولیتر محیط کشت بدون سرم‌ تعداد 104×12 سلول­ کشت داده شد. پلیت به مدت یک شب ‌تحت شرایط 5 درصد دی‌اکسید کربن، رطوبت 80 درصد و دمای 37 درجه سانتی­‌گراد انکوبه شد.
در این تست از محیط کشت به‌عنوان بلانک و از محیط کشت حاوی سلول به‌عنوان کنترل استفاده شد. پس از آن محیط کشت اولیه هر چاهک تست، تخلیه و 300 میکرولیتر محیط کشت جدید (فاقد سرم) و حاوی غلظت‌های مختلف 20 و 40 میکروگرم در میلی­‌لیتر از فراکشن­‌های (دارای خواص ضد‌باکتریایی) به آن اضافه شد. پلیت حاوی سلول­ به‌مدت 24 ساعت در شرایط دمای 37 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 80 درصد و 5 درصد دی‌اکسید‌کربن انکوبه شد. 
پس از پایان زمان ذکرشده، سلول‌های هر چاهک با استفاده از تریپسین جدا و در تیوپ 1/5 میلی­‌لیتری جمع‌آوری شدند. میکروتیوپ­‌های حاوی سلول به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با دور MPR1500 سانتریفیوژ شدند و محلول رویی تخلیه شد. جهت شست‌وشوی سلول‌ها به هر‌یک از لوله­‌ها 400 میکرولیتر (‌7/4=PBS‌(pH‌اضافه و پس از سانتریفیوژ با شرایط ذکر‌شده مایع رویی تخلیه شد. 
سپس به لوله­‌ها 200 میکرولیتر PBS اضافه شد و با کمک سمپلر و سرنگ انسولین، سلول‌ها از یکدیگر جدا شدند و به‌صورت منفرد درآمدند. اسلاید­های مورد نیاز برای تست با آگاروز با نقطه ذوب نرمال (NMA 1 درصد) پوشش داده شد. سوسپانسیون سلولی با آگارز با نقطه ذوب پایین (LMA 1 درصد) ‌به نسبت 1 به 2 مخلوط و روی اسلایدها ریخته شد. جهت ایجاد یک لایه سلول روی هر اسلاید، یک لامل روی اسلاید قرار داده شد. 
جهت لیز شدن غشاهای سلول و هسته، تمام اسلایدها در بافر لیز‌کننده (NaCl 2.5M ،‌EDTA 100mM ،‌Tris 10mM  NaOH 0.2M ،‌Triton X-100 ‌و یک درصد 10=pH‌) سرد و تازه به مدت 16-18 ساعت، درون یخچال قرار داده شدند. پس از خارج کردن بافر لیز‌کننده، اسلایدها 20 دقیقه و در 2 نوبت با بافر الکتروفورز (NaOH 300mM ،‌EDTA 1mM و pH>13) شست‌وشو و پس از آن به منظور باز شدن DNA به مدت 40 دقیقه درون بافر الکتروفورز سرد و در یخچال انکوبه شدند. 
 اسلایدها از محلول خارج و درون تانک الکتروفورز حاوی بافر قرار داده شد و الکتروفورز در شرایط دمایی 4 درجه سانتی‌­گراد به مدت 45 دقیقه تحت ولتاژ 25 و جریان 300 میلی‌آمپر انجام شد. برای خنثی‌سازی محیط بازی، نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه درون بافر خنثی‌کننده (Tris 400mM ،pH=7/5) قرار داده شدند. جهت رنگ‌آمیزی سلول­‌ها به هر اسلاید 100 میکرولیتر از محلول اتیدیوم بروماید با غلظت 20 میکروگرم در میلی‌­لیتر اضافه و به مدت زمان 10 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند. بعد از آن اسلایدها به مدت 10 دقیقه با آب 2 بار تقطیر شسته و توسط میکروسکوپ فلورسنت مطالعه شدند. برای هر نمونه حداقل از DNA 100 سلول تصویر، تهیه و نتایج تجزیه‌وتحلیل آماری شد.
تحلیل آماری
نتایج هر تست به‌صورت میانگین و انحراف‌معیار گزارش و داده‌­های به‌دست‌آمده با استفاده از نرم‌افزار (GraphPad InStat) تجزیه‌وتحلیل آماری شد. غلظت­‌های مختلف سم نسبت به گروه کنترل و نیز نسبت به یکدیگر با آزمون آماری تحلیل واریانس یک‌طرفه و آزمون توکی بررسی شد. ‌05/P<0 به‌عنوان معنا­دار بودن ‌نتایج درنظر گرفته شد. ترسیم نمودارها در فضای نرم‌افزار مایکروسافت اکسل نسخه 2013 انجام گرفت.
یافته‌ها
نتایج بررسی الگوی الکتروفوروزی و کروماتوگرافی زهر خام
وزن مولکولی باند­ها با استفاده از نمودار پروتئین استاندارد تعیین شد. نتایج SDS-PAGE (ژل 15 درصد) وجود 10 باند پروتئینی با وزن مولکولی تقریبی 13/2، 19/6، 24/2، 27/91، 39/8، 54/8، 65/35، 75/4، 98/32 و 99/25 کیلو­دالتون را نشان داد (تصویر شماره 1).

نتایج حاصل از جداسازی فراکشن‌های زهر خام توسط HPLC‌، وجود 11 پیک مجزا و عمده را نشان داد (تصویر شماره 2).

فراکشن‌ها‌ی جمع‌آوری‌شده، به‌ترتیبِ زمان خروج از ستون به نام‌های F1 تا F11 نام‌گذاری شدند. فراکشن‌ها متناظر با هر پیک در شیشه‌های تمیز و عاری از هر‌گونه آلودگی جمع‌آوری و پس از لیوفیلیز کردن در دمای 80- نگهداری شد. زمان خروج محصول متناظر با هر پیک در جدول شماره 1 ارائه شده است.

پروتئین‌سنجی نتایج نشان داد فراکشن‌­های 1، 2 و 11 فاقد پروتئین هستند که از بررسی‌های بعدی حذف شدند (جدول شماره 2).

نتایج بررسی‌های ضد‌­باکتریایی
نتایج بررسی میزان اثر ضد‌باکتریایی فراکشن‌ها با استفاده از MTT Assay
نتایج نشان داد فراکشن‌­های 3، 4، 7 و 9 بر باکتری اشرشیاکلی اثر مهاری نداشتند، اما فراکشن‌های 5، 6، 8 و 10 اثرات ضد‌باکتری از خود نشان دادند، به ترتیبی که  درصد حیاتی باکتری با این ترتیب 81/55، 81/2، 69/87 و 71/45 درصد بوده است. با تحلیل آماری انجام‌شده مشخص شد فراکشن‌های اخیر بر رشد باکتری در مقایسه با کنترل منفی (محیط کشت نرمال واجد باکتری) اثر مهاری معنادار ایجاد کردند، اما میزان مرگ‌ومیر ناشی از آن‌ها در مقایسه با تتراسایکلین به‌عنوان کنترل مثبت معنادار نبود (تصویر شماره 3).

همچنین نتایج تست در مورد باکتری باسیلوس سوبتیلیس نشان داد درصد حیاتی آن در محیط کشت حاوی فراکشن‌های 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 و 10 به‌ترتیب 78/41، 0/35، 99/91، 81/27، 100، 98/94، 81/15 و 97/49 درصد بوده است. فراکشن‌های 3، 4، 6 و 9 بر رشد این باکتری در مقایسه با کنترل منفی رشد بازدارندگی معنادار ایجاد کرده که از میان آن‌ها فراکشن­ شماره 4 ‌اثر مهاری بیشتری از آنتی‌بیوتیک استاندارد (تتراسایکلین) داشته است (تصویر شماره 3). 
درصد حیاتی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در محیط کشت حاوی فراکشن­‌های 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 و 10، به‌ترتیب 91/58، 69/23، 70/47، 81/38، 100، 96، 99/76 و 95/76 بوده است. تحلیل آماری داده‌ها نشان داد فراکشن‌­های 4، 5 و 6 بر رشد باکتری در مقایسه با کنترل منفی رشد مهاری معنادار ایجاد کردند. بیشترین اثر مهاری فراکشن‌‌های جداشده از زهر خام به فراکشن شماره 4 با اثر مهاری حدود 30/77 درصد تعلق داشته که از اثر مهاری تتراسایکلین‌ به‌صورت معناداری کمتر بوده است (تصویر شماره 3).
نتایج بررسی میزان اثر ضد‌باکتری فراکشن‌ها با استفاده از روش حداقل غلظت مهاری
نتایج اثرات مهاری فراکشن‌های جداسازی‌شده با غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بر رشد باکتری‌ها نشان داد فراکشن‌های 3 و 9 بر باکتری اشرشیاکلی بی‌تأثیر بودند، اما  فراکشن­‌های 4، 5، 6، 7، 8 و 10 به‌ترتیب 5/21، 3/48، 25/2، 17/71، 17/8 و 13/06 درصد بر رشد باکتری اثر مهاری داشتند. با بررسی آماری انجام‌شده مشخص شد فراکشن شماره 6 نسبت به سایر فراکشن‌­ها  اثر مهاری بیشتری داشت، اما این اثر در مقایسه با آنتی بیوتیک استاندارد معنادار نبود (تصویر شماره 4).

یافته­‌ها نشان داد فراکشن­‌های شماره 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 و 10 در باکتری باسیلوس سوبتیلیس به‌ترتیب 24/06، 98/46، 28/77، 13/14، 17/88، 12/30، 13/76 و 2/61 اثر مهاری ایجاد کردند. بررسی آماری نشان داد تلفات ناشی از اثر فراکشن‌­های 3، 4، 5، 6، 7، 8 و 9 بر باکتری در مقایسه با کنترل منفی معنادار بود. در مقایسه با سایر فراکشن‌ها،‌ اثر مهاری فراکشن­ 4 بر رشد این باکتری در مقایسه با کنترل مثبت (تتراسایکلین) بسیار بیشتر، اما این اثر معنادار نبود (تصویر شماره 4). 
همچنین با بررسی انجام‌شده مشخص شد فراکشن‌­های شماره 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 و 10 بر رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مؤثر بود و به‌ترتیب 25/46، 13/85، 25/88، 9/85، 15/88، 2/28، 4/74 و 3/03 درصد اثر مهاری بر آن القا کردند. اثر مهاری فراکشن­‌های شماره 3، 4، 5، 6 و 7 بر این باکتری در مقایسه با کنترل منفی معنادار، اما نسبت به آنتی­‌بیوتیک استاندارد معنادار نبود (تصویر شماره 4).
نتایج بررسی خواص ضد‌سرطانی فراکشن‌ها
جمع‌بندی نتایج حاصل از بررسی اثرات ضد‌باکتریایی فراکشن‌های جدا‌شده از زهر خام مار شاخ‌دار ایرانی و تحلیل آماری داده‌ها نشان دادند فراکشن‌های 4 و 8 در مقایسه با سایر فراکشن‌ها اثرات مهاری بیشتری بر باکتری‌های مورد تست القا کردند؛ بنابراین در این مطالعه به اثر ضد‌سرطانی و میزان سمیت سلولی آن‌ها توجه شد.
نتایج تست بررسی میزان سمیت سلولی با روش MTT Assay 
بررسی اثرات سمیت سلولی فراکشن‌­های 4 و 8 جداشده از زهر خام بر رشد سلول‌های سرطانی کبد در 2 غلظت 20 و 40 میکروگرم در میلی‌لیتر نشان داد درصد حیاتی سلول‌ها تحت تأثیر فراکشن 4 در 2 غلظت ذکرشده در مقایسه با کنترل به‌ترتیب 51/55 و 50/62 درصد بوده است. این در حالی است که درصد حیاتی سلول پس از تماس با فراکشن 8 در غلظت‌های فوق ‌افزایش یافته و به‌ترتیب به 82/29 و 74/81 رسیده است. تحلیل آماری داده‌ها نشان داد اثرات فراکشن‌های شماره 4 و 8 در مهار رشد سلول در 2 غلظت 20 و 40 میکروگرم در میلی‌لیتر در مقایسه با کنترل معنادار بود، اما اثر مهاری 2 غلظت هر‌یک از فراکشن‌ها نسبت به یکدیگر معنادار نبود (تصویر شماره 5).

نتایج بررسی سمیت سلولی فراکشن‌ها با روش رنگ‌سنجی قرمز خنثی
 نتایج حاصل از مطالعه اثر سمیت سلولی فراکشن‌های 4 و 8 با استفاده از تست رنگ قرمز خنثی نشان داد مرگ‌و‌میر حاصل از فراکشن شماره­ 4 در 2 غلظت 20 و 40 میکروگرم در میلی‌لیتر در سلول به‌ترتیب 35/19 و 50/93 درصد و در مورد فراکشن شماره 8 به‌ترتیب 82/29 و 74/81 درصد بود که نسبت به کنترل معنادار بود (تصویر شماره 6).

نتایج بررسی القای آپوپتوزیس توسط  فراکشن‌ها با استفاده از تست کامت قلیایی
نتایج بررسی آزمایش کامت قلیایی نشان داد فراکشن شماره 4 در 2 غلظت 20 و 40 میکروگرم در میلی‌لیتر به‌ترتیب 39/31 و 38/97 درصد و فراکشن شماره 8 ‌در 2 غلظت فوق به‌ترتیب 24/73 و 25/34 درصد آپوپتوز در سلول سرطانی کبد ایجاد شد که در مقایسه با کنترل معنا‌دار بود (تصاویر شماره 7، 8، 9).

بحث
زهر مارهای سمی، مجموعه‌ای از مولکول‌­هایی با فعالیت‌‌های مختلف بیولوژیکی­ است که می­‌تواند در تحقیقات پزشکی و زیست‌شناسی بسیار مورد توجه قرار گیرد [18]. جداسازی پروتئین‌­های زهر با استفاده از روش‌های الکتروفورز برای اولین بار بیش از 40 سال پیش توسط محققان انجام شده است [19]. 
از آنجا که پروتئین‌ها و پپتیدهای موجود در سم مار، دامنه وسیعی از اندازه مولکولی و همچنین خصوصیات بیوشیمیایی دارد، تجزیه‌وحلیل پروتئوم می‌­تواند در شناسایی و جداسازی این ترکیبات بسیار حائز اهمیت باشد [20]. در مطالعه حاضر، به منظور بررسی مشخصات الگوی پروتئینی زهر از یک استراتژی ترکیبی از روش‌های الکتروفورزیس و کروماتوگرافی استفاده شده است. بررسی الگوی کروماتوگرافی سم مار شاخ‌دار ایرانی در سال 2004 توسط مهریار امینی‌نسب با استفاده از ژل فیلتراسیون Sephadex G-50  مطالعه و تعداد 6 فراکشن از سم خام جدا شد [21]. 
در این مطالعه برای بررسی الگوی کروماتوگرافی سم از روش RP-HPLC استفاده شد که در‌نهایت، 11 فراکشن از آن جداسازی و جمع‌آوری شد. نتایج پروتئین‌سنجی نشان داد تنها 8 فراکشن از فراکشن­‌های جداسازی‌شده پروتئین دارند. به‌علاوه، یافته‌های ما در این تحقیق وجود 10 بند پروتئینی را در الگوی الکتروفورزی (SDS-PAGE) نشان داد. اختلاف موجود در نتایج الگوی الکتروفورزی با الگوی کروماتوگرافی احتمالاً به این علت است که برخی از پروتئین‌­ها در محدوده وزنی نزدیکی به ­هم قرار داشتند و هنگام جداسازی تحت یک فراکشن جمع‌­آوری می­‌شوند. 
در مطالعات قبلی نشان داده شد الگوی الکتروفورز و کروماتوگرافی مار­های مختلف، متفاوت است [22, 23, 24, 25, 26]. از طرفی، در بسیاری از این مطالعات با جداسازی اجزای مختلف زهر، پروتئین­‌ها و پپتید­هایی جداسازی‌شده است که خواص درمانی ­بالایی دارند که می‌تواند پیامدهای گسترده‌­ای برای پزشکی داشته باشد [27, 28, 29 ,30]. رشد نگران‌کننده­ بیماری­‌های عفونی ناشی از مقاومت­‌های باکتریایی باعث تحقیق و بررسی بیشتر دانشمندان در منابع طبیعی و از‌جمله زهر جانوران سمی مختلف مانند مارها برای کشف آنتی‌بیوتیک‌­های مؤثرتر و جدیدتر شده است.
نتیجه‌گیری
براساس نتایج به‌دست‌آمده از تحقیق حاضر مشخص شد سم خام مار شاخ‌دار ایرانی خواص ضدباکتریایی دارد. همچنین سم خام این مار علیه باکتری­‌های گرم مثبت (باسیلوس سوبتیلیس و استافیلوکوکوس اورئوس) دارای اثرات مهاری بالا و علیه باکتری گرم منفی اشرشیاکلی فقط در بالاترین غلظت مورد استفاده (400 میکروگرم بر میلی‌لیتر) اثرات مهاری دارد؛ بنابراین در این قسمت از تحقیق سعی شد اجزای سم خام، جداسازی و میزان فعالیت هر فراکشن علیه باکتری­‌های ذکر‌شده بررسی شود. به این منظور از روش‌های MTT Redaction و MIC Assay استفاده شد.
مطابق با نتایج، فراکشن شماره 4 بیشترین اثرات مهاری را بر رشد باکتری­‌های گرم مثبت دارد. اثر مهاری این فراکشن بر باکتری باسیلوس سوبتیلیس اثر 99 درصد و در مورد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس 31 درصد بوده است. فراکشن شماره 8 با 30 درصد مهار بیشترین اثر مهاری را بر رشد باکتری اشرشیاکلی داشت. 
این نتایج در مقایسه با داده‌­های به‌دست‌آمده از مطالعه اثرات ضد­باکتریایی سم­ خام مار ذکر‌شده بر این باکتری­‌ها کاملاً مطابقت دارد. در صورت انتخاب این فراکشن­‌ها به‌عنوان آنتی‌بیوتیک جهت استفاده در ‌حیوان یا انسان می­‌بایست سمیت سلولی آن‌ها بر سلول بررسی می‌شد؛ بنابراین اثرات سمیت سلولی فراکشن‌‌های انتخابی (دارای خواص ضدباکتریایی) با استفاده از روش­‌های MTT Assay ،Neutral Red Uptake Assay  و Single Cell Gel Electrophoresis (Comet Assay)  بر سلول سرطانی کبد (رده سلولی HepG2) بررسی شد.
نتایج این بخش از مطالعه نشان داد فراکشن شماره 8 کمترین سمیت را در سلول القا کرده است. این ویژگی، این فراکشن را یک کاندید مناسب جهت جداسازی مولکول‌های مؤثر با خواص ضدباکتریایی که کمترین اثرات جانبی روی سلول‌های انسانی را دارد، معرفی می‌کند. فراکشن شماره 4 نیز بیشترین تأثیر را بر سلول‌های سرطانی القا کرد که با‌توجه‌به نتایج آزمایش کامت قلیایی این اثرات، بیشتر از طریق القای آپاپتوز انجام می‌شود؛ بنابراین باتوجه‌به این نتیجه، این فراکشن کاندیدای مناسبی برای استفاده در جهت کشف دارو­های ضد­سرطان خواهد بود. مطالعات قبلی در مورد سم خام‌ مارها نیز نشان داده بود سم آن‌ها خواص ضد­سرطانی دارد [31]. 
در یک نتیجه‌گیری کلی می‌توان گفت براساس نتایج تحقیق حاضر، فراکشن شماره 8، قابلیت توسعه مطالعه جهت ارزیابی‌های بیشتر به‌عنوان آنتی‌بیوتیک و فراکشن شماره 4 به‌عنوان یک ماده با اثرات ضد‌سرطانی را دارد.

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
باتوجه‌به اینکه در این مطالعه از موجود زنده مانند حیوان، مدل و غیره استفاده نشده است؛ لذا برای دریافت کد اخلاق اقدام نشد.

حامی مالی
این پژوهش هیچ‌گونه کمک مالی از سازمانی‌های دولتی، خصوصی و غیرانتفاعی دریافت نکرده است.

مشارکت نویسندگان
تمام نویسندگان در آماده‌سازی این مقاله مشارکت داشتند.

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.

تشکر و قدردانی
از همکاری صمیمانه اعضای گروه علوم زیستی دانشگاه جامع امام حسین (ع) که در انجام مراحل تحقیق ما را یاری کردند، تشکر و قدردانی می‌شود.

References

1. Keshavarz Alikhani H, Zargan J, Bidmeshkipour A, Haji Nour Mohammadi A, Hosseinpour M, Heydari A, et al. Antibacterial activity of the Iranian scorpion’s crude venom (Odontobuthus bidentatus) on gram-positive and gram-negative bacteria. Iranian J Toxicol. 2020; 14(2):105-10. [DOI:10.32598/ijt.14.2.627]
2. Zargan J, Mirzaei Nodushan M, Sobati H, Goodarzi H, Haji Noor Mohammadi A, Ebrahimi F. [Anti-cancer and anti-bacterial effects of crude venom of Pseudocerastes persicus snake (Persian)]. Koomesh. 2020; 22(3):518-28. [DOI:10.29252/koomesh.22.3.518]
3. de Lima DC, Alvarez Abreu P, de Freitas CC, Santos DO, Borges RO, Dos Santos TC, et al. Snake Venom: Any clue for antibiotics and CAM? Evid Based Complement Alternat Med. 2005; 2(1):39-47. [DOI:10.1093/ecam/neh063] [PMID] [PMCID]
4. Ferreira S. A bradykinin-potentiating factor (BPF) present in the venom of Bothrops jararaca. Br J Pharmacol Chemother. 1965; 24(1):163-9. [DOI:10.1111/j.1476-5381.1965.tb02091.x] [PMID] [PMCID]
5. Aloof-Hirsch S, de Vries A, Berger A. The direct lytic factor of cobra venom: Purification and chemical characterization. Biochim Biophys Acta. 1968; 154(1):53-60. [DOI:10.1016/0005-2795(68)90257-2] [PMID]
6. Xie JP, Yue J, Xiong YL, Wang WY, Yu SQ, Wang HH. In vitro activities of small peptides from snake venom against clinical isolates of drugresistant Mycobacterium tuberculosis. Int J Antimicrob Agents. 2003; 22(2):172-4. [DOI:10.1016/S0924-8579(03)00110-9] [PMID]
7. Markland FS. Snake venoms. 1997; 54(S3):1-10. [DOI:10.2165/00003495-199700543-00003] [PMID]
8. Stábeli RG, Marcussi S, Carlos GB, Pietro RC, Selistre-de-Araújo HS, Giglio JR, et al. Platelet aggregation and antibacterial effects of an L-amino acid oxidase purified from Bothrops alternatus snake venom. Bioorg Med Chem. 2004; 12(11):2881-6. [DOI:10.1016/j.bmc.2004.03.049] [PMID]
9. Lu QM, Wei Q, Jin Y, Wei JF, Wang WY, Xiong YL. L-Amino acid oxidase from Trimeresurus jerdonii snake venom: purification, characterization, platelet aggregation-inducing and antibacterial effects. J Nat Toxins. 2002; 11(4):345-52. [PMID]
10. Chellapandi P, Jebakumar SRD. Purification and antibacterial activity of indian cobra and viper venoms. Electronic Journal of Biology. 2008; 4(1):11-6. [Link]
11. Steuten J, Winkel K, Carroll T, Williamson NA, Ignjatovic V, Fung K, et al. The molecular basis of cross-reactivity in the Australian Snake Venom Detection Kit (SVDK). Toxicon. 2007; 50(8):1041-52. [DOI:10.1016/j.toxicon.2007.07.023] [PMID]
12. Wang H, Cheng H, Wang F, Wei D, Wang X. An improved 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) reduction assay for evaluating the viability of Escherichia coli cells. J Microbiol Methods. 2010; 82(3):330-3. [DOI:10.1016/j.mimet.2010.06.014] [PMID]
13. Hossein Pour M, Zargan J, Honari H, Haji Nour Mohammadi A, Hajizadeh A, Keshavarz Alikhani H, et al. Introduction of Dianthins: A new promising horizon toward continuous research on breast cancer bulldozing in Iran. Int J Med Toxicol Forensic Med. 2019; 9(3):133-4 [10.32598/ijmtfm.v9i3.25706]
14. Shebl RI, Mohamed AF, Ali AE, Amin MA. Antimicrobial profile of selected snake venoms and their associated enzymatic activities. Microbiol Res J Int. 2012; 2(4):251-63. [DOI:10.9734/BMRJ/2012/2091]
15. Dezianian S, Zargan J, Goudarzi HR, Haji Noormohamadi A, Mousavi M, Keshavarz Alikhani H, et al. In-vitro study of hottentotta schach crude venom anticancer effects on MCF-7 and vero cell lines. Iran J Pharm Res.2020; 19(1):192-202. [DOI:10.22037/ijpr.2020.1100957] [PMID] [PMID]
16. Kamran MR, Zargan J, Keshavarz Alikhani H, Hajinoormohamadi A. The comparative cytotoxic effects of apis mellifera crude venom on MCF‑7 breast cancer cell line in 2D and 3D cell cultures. Int J Pept Res Ther. 2020; 26:1819-28. [Link]
17. Mousavi M, Zargan J, Haji Noor Mohammadi A, Goudarzi HR, Dezianian S, et al. Anticancer effects of the Latrodectus dahli crude venom on MCF-7 breast cancer cell line. Breast J. 2019; 25(4):781-2. [DOI:10.1111/tbj.13332] [PMID]
18. Suntravat M, Nuchprayoon I, Perez JC. Comparative study of anticoagulant and procoagulant properties of 28 snake venoms from families Elapidae, Viperidae, and purified Russell’s viper venom-factor activator (RVV-X). Toxicon. 2010; 56(4):544-53. [DOI:10.1016/j.toxicon.2010.05.012] [PMID] [PMCID]
19. Master RWP, Rao SS. Identification of enzymes and toxins in venoms of Indian cobra and Russell’s viper after starch gel electrophoresis. J Biol Chem. 1961; 236(7):1986-90. [DOI:10.1016/S0021-9258(18)64116-X]
20. Phizicky E, Bastiaens PIH, Zhu H, Snyder M, Fields S. Protein analysis on a proteomic scale. Nature. 2003; 422(6928):208-15. [DOI:10.1038/nature01512] [PMID]
21. Amininasab M, Elmi MM, Endlich N, Endlich K, Parekh N, Naderi-Manesh H, et.al. Functional and structural characterization of a novel member of the natriuretic family of peptides from the venom of pseudocerastes persicus. FEBS Lett. 2004; 557(1-3):104-8. [DOI:10.1016/S0014-5793(03)01455-8] [PMID]
22. Nawarak J, Sinchaikul S, Wu CY, Liau MY, Phutrakul S, Chen ST. Proteomics of snake venoms from Elapidae and Viperidae families by multidimensional chromatographic methods. Electrophoresis. 2003; 24(16):2838-54. [DOI:10.1002/elps.200305552] [PMID]
23. Rioux V, Gerbod MC, Bouet F, Menez A, Galat A. Divergent and common groups of proteins in glands of venomous snakes. Electroph 1998; 19(5):788-96. [DOI:10.1002/elps.1150190531] [PMID]
24. Fry BG, Wüster W, Ryan Ramjan SF, Jackson T, Martelli P, Kini RM. Analysis of colubroidea snake venoms by liquid chromatography with mass spectrometry: Evolutionary and toxinological implicat Rapid Commun Mass Spectrom. 2003; 17(18):2047-62. [DOI:10.1002/rcm.1148] [PMID]
25. Mehdizadeh-Kashani T, Vatanpour H, Zolfagharian H, Hooshdar-Tehrani H, Heydari MH, et al. Partial fractionation of venoms from two iranian vipers, echis carinatus and cerastes persicus fieldi and evaluation of their antiplatelet activity. Iran J Pharm Res. 2012; 11(4):1183-9. [PMID] [PMCID]
26. Bhaskar M, Monica K, Amod K. Determination of molecular mass and partial peptide confirmation of short neurotoxins using chromatographic techniques and reverse phase HPLC. Int J Appl Biol Pharm Technol. 2011; 2(4):150-7. [Link]
27. Barker RA, Ratcliffe E, McLaughlin M, Richards A, Dunnett SB. A role for complement in the rejection of porcine ventral mesencephalic xenografts in a rat model of Parkinson’s disease. J Neurosci. 2000; 20(9):3415-24. [DOI:10.1523/JNEUROSCI.20-09-03415.2000] [PMID] [PMCID]
28. Zhao X, Yeh JZ, Narahashi T. Post-stroke dementia: Nootropic drug modulation of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Annu N Y Acad Sci. 2001; 939(1):179-86. [DOI:10.1111/j.1749-6632.2001.tb03624.x] [PMID]
29. Marcinkiewicz C, Weinreb PH, Calvete JJ, Kisiel DG, Mousa SA, Tuszynski GP, et al. Obtustatin: A potent selective inhibitor of α1β1 integrin in vitro and angiogenesis in vivo. Cancer Res. 2003; 63(9):2020-3. [PMID]
30. Li S, Wang J, Zhang X, Ren Y, Wang N, Zhao K, et al. Proteomic characterization of two snake venoms: Naja naja atra and Agkistrodon halys. Biochem J. 2004; 384(1):119-27. [DOI:10.1042/BJ20040354] [PMID] [PMCID]
31. Angulo Y, Lomonte B. Inhibitory effect of fucoidan on the activities of crotaline snake venom myotoxic phospholipases A2. Biochem Pharmacol. 2003; 66:1993-2000. [DOI:10.1016/S0006-2952(03)00579-3]