مقدمه
بررسی تغییرات بیان lncRNA UCA1 و ژن هدف AKT تنظیمکننده مسیر سیگنالی PI3K/AKT در رده سلولی لوسمی حاد لنفوبلاستیک Jurkat E6.1 تحت تیمار با کمپلکسهای تیوسمی کاربازون. لوسمی لنفوبلاستی حاد بیماری بدخیم مغز استخوان است که در آن پیشسازهای اولیه لنفوئید تکثیر و جایگزین سلولهای طبیعی خونساز مغز میشوند.
لوسمی، شایعترین نوع سرطان کودکان است و سهچهارم موارد لوسمی در کودکان از نوع لنفوبلاستی حاد است. در لوسمی مغز استخوان به صورت غیرعادی، مقدار بسیار زیادی سلول خونی تولید میکند که این سلولها با دیگر سلولهای بدن متفاوت بوده و درست عمل نمیکنند [
2 ،1].
این بیماری معمولاً میان سنین دو تا پنج سالگی بروز میکند [
4 ،3]. T_ALL بیماری ناشی از ناهنجاریهای مولکولی است و بر سلولهای بنیادی تولیدکننده لنفوئید تأثیر دارد و در انکوژنزایی کلیدی و مسیرهای رشدی اختلال ایجاد میکند [
7-5]. لوسمی پنجمین سرطان شایع در بین هر دو جنس است. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی، لوسمی در سراسر جهان و ایران در حال افزایش بوده و طبق آمار سیستم ثبت سرطان در ایران لوسمی بین چهار سرطان کشنده در این کشور قرار دارد [
8].
رده سلولی 1-Jurkat E6 توسط اشنایدر و همکارانش از خون محیطی پسری چهارده ساله گرفته شد. سلولهای 1-E6 پس از تحریک با استرهای فوربول یا لکتین یا آنتیبادی مونوکلونال علیه آنتیژن T3 مقادیر زیادی 2-IL تولید میکنند.) هر دو نوع محرک برای القای تولید IL-2 لازم است [
9].
مسیرهای سیگنالی مختلفی در رشد و تکثیر سلول نقش دارند.[
11 ،10] مسیر سیگنالی PI3K / AKT در رشد و تکثیر سلول و کنترل متابولیسم در سـلولهـای سـالم و سرطانی دخالت دارد.اجزای این مسیر در بسیاری از انواع سرطانها با افزایش عملکرد همراه بوده و این امر مهمترین دلیل افـزایش بقـا و کـاهش مـرگ سـلولهـای سرطانی است. از این رو، فعال شدن بیش از حد این مسیر در بدخیمیهای انسان و پیشرفت سرطان نقش دارد. برخی از جهشهای فعالکننده در PI3K / AKT نیز در تومورهای انسانی شایع هستند؛ بنابراین ممکن است رشد تومور را تقویت کنند. [
16-12]
LncRNAها به عنوان RNAهای غیرکدکننده طولانی در طیف گستردهای از فرایندهای مهم بیولوژیکی، ازجمله رونویسی، ترجمه و اپوپتوز نقش مهمی دارند. [
20-17] شاید آنها پیشرفت سرطان و پیشرفت بسیاری از بیماریهای انسانی را تنظیم کنند [
21]. LncRNA UCA1 دارای موقعیت 19p13.12 و دارای 3 اگزون است. این ژن به نامهای CUDR; UCAT1; LINC00178; NCRNA00178; onco-lncRNA-36 شناخته میشود [
22].
این ژن یک RNA بدون کدگذاری طولانی است که در سرطان نقش مهمی در تکثیر و تمایز سلولی دارد [
23]. lncRNA UCA1 عمدتاً در سیتوپلاسم واقع شده و با RNAهای بالغ یا پروتئینها در تعامل است و آنها را تنظیم میکند [
24]. UCA1 بهطور گسترده در بافتهای جنینی بیان شده و در بیشتر بافتهای طبیعی بزرگسالان (به جز قلب و طحال) بیان نمیشود [
25]. در مسیر سیگنالی PI3K / AKT ،UCA1 بیان p-PI3K و p-AKT3 را افزایش داده و مسیر PI3K / AKT را بهطور غیرطبیعی فعال میکند تا اثر انکوژنیکی خود را اعمال کند [
27 ،
26]. خاموش کردن UCA1 سطح بیان p-Akt را کاهش میدهد که میتواند حساسیت شیمیایی را افزایش دهد.
این یافتهها نشان داد که UCA1 ممکن است نقش اساسی در پیشرفت سرطانهای مختلف داشته باشد [
28]. ژن AKT در جایگاه q32.33 14 قرار داشته و 14 اگزون دارد. این ژن به نامهای AKT; PKB; RAC; CWS6; PRKBA; PKB-ALPHA; RAC-ALPHA خوانده میشود. AKT نقش کلیدی در فرایندهای سلولی مختلف، ازجمله بقای سلولی، رشد، متابولیسم و مهاجرت سلولی داشته و نهایتاً به مهار آپوپتوز و افزایش تکثیـر منجر میشود [
22].
داروهای مورد استفاده در درمان سرطان یا با خود DNA ترکیب میشوند و عمل آتی آن را برای تولید مثل مختل میکنند یا از سنتز پورین و پریمیدین که برای ساخته شدن DNA لازم است، جلوگیری میکنند، ازجمله داروهای مورد استفاده در سرطان خون میتوان به مرکاپتوپورین (6mp) و تیوسمی کاربازون اشاره کرد. مرکاپتوپورین (6mp) یک داروی شیمیایی است که به تنهایی یا همراه با سایر داروهای شیمی درمانی برای درمان لوسمی لنفوسیتی حاد (ALL) استفاده میشود. مرکاپتوپورین (6mp) در کلاس داروهای موسوم به آنتاگونیستهای پورین قرار دارد و یک آنالوگ سمی از آدنین است که مانع از فعالیت RNA و سنتز پروتئین میشود و در توقف رشد سلولهای سرطانی کاربرد دارد [
29].
تیوسمی کاربازون از عوامل ضدسرطان مؤثر هستند و از طریق مهار ریبونوکلئوتید ردوکتاز به عنوان مهارکنندههای قوی در سنتز DNA عمل میکنند [
30]. هدف از انجام این پروژه بررسی تغییرات بیان lncRNA UCA1 و ژن هدف AKT تنظیمکننده مسیر سیگنالی PI3K / AKT در رده سلولی لوسمی حاد لنفوبلاستیک 1-Jurkat E6 تحت تیمار با غلظتهای متفاوت 2، 1، 0/5 و 5 ماکرومولار از کمپلکس تیوسمی کاربازون (نیکل) و غلظتهای 10، 5، 1 و 25 ماکرومولار از داروی 6mp در زمانهای متفاوت 24، 48 و 72 ساعت و مقایسه آنها نسبت به زمان، غلظت و نسبت به سلولهای لنفوبلاستومای تیمارنشده با داروهای 6mp و Ni است.
روش بررسی
پژوهش کنونی از نوع مطالعه آزمایشگاهی (in vitro) از فروردین تا شهریور سال 1397 در مرکز علوم تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی زنجان انجام شده است. سلول های لوسمی لنفوبلاستیک حاد رده 1-Jurkat E6 انسانی از انستیتو پاستور ایران در پاساژ یک و تراکم 80 (2×105cell/cm2) درصد خریداری شدند.
کشت و پاساژ سلول، شمارش سلول و تهیه غلظتهای متفاوت از دارو: ابتدا سلولهای لوسمی لنفوبلاستیک حاد رده 1-Jurkat E6 در محیط کشت Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (RPMI 90%) که دارای FBS 10 درصد بوده کشت داده شد و در انکوباتور در دمای 37˚c حاوی دی اکسیدکربن 5 درصد به مدت شش روز قرار داده شد و سه پاساژ، دو روز یکبار بر سلولها اعمال شد و در هر پاساژ سلولها وارد فلاسک با محیط کشت جدید شدند.
سپس سلولهای پاساژ چهارم برای مراحل بعدی انتخاب شد، سلولها تحت شمارش سلولی و رنگآمیزی با تریپان بلو قرار گرفتند و تعداد سلولها برابر با cell/cm2 104×3 تعیین شد. سلولها به دو گروه کنترل و آزمایش تقسیم شدند. یک عدد قرص 6mp که معادل 50 گرم بود را در 10 سیسی آب مقطر حل کرده، برای Ni نیز 0/001 گرم از Ni را در 1 سیسی آب حل کردیم. سپس بررسی دُز مؤثر داروهای مورد استفاده (6mp و تیوسمی کاربازون) توسط آزمون MTT تجزیه و تحلیل شد و گروه تیمار با غلظتهای 1، 5، 10، 25 ماکرومولار از داروی 6mp تهیه شده در حلال H2O و غلظتهای 1، 2، 5، 0/5 ماکرومولار از داروی Ni (تیوسمی کاربازون) تهیه شده در حلال H2O در سه گروه زمانی 24، 48، 72 ساعت استفاده شدند. سلولهای کنترل نیز سلولهایی فاقد دارو بودند.
استخراج RNA، سنتزcDNA و Real Time PCR: سلولها پس از گذراندن زمانهای ذکرشده برای بررسی میزان بیان ژن، ابتدا استخراج RNA توسط (High pure viral Nucleic Acid Kit Roche Diaghostics Gmbh ,Manheim ,Germany Cat#11858874001) و مطابق با دستور کارکیت انجام شد. با استفاده از کیت (Takara Bio ,Otsu ,Japan ,Cat#RR037Q) و مطابق با دستور کارکیت گفتهشده از رویRNA حاصله، cDNA ساخته شد. ترکیبات لازم جهت سنتز با حجم نهایی 20 μl شامل: Primer script Buffer(1X) 10μl ،RT enzyme 2μl ،template RNA 5µg ،DEPC-treated water تا حجم 20 ماکرولیتر است. محتویات به مدت 10 دقیقه در 25 درجه، 60 دقیقه در 47 درجه و سپس 5 دقیقه در 85 درجه قرار گرفتند.
با استفاده از دستگاه Rotor-Gene Q real-time PCR cycler(Qiagen ,Hilden ,Germany) و بهکارگیری دستور کارکیت Syber green (Takara Bio ,Otsu ,Japan ,Cat # (RR820Q، ژنهای UCA1 و AKT و GAPDH به عنوان ژن مرجع برای هر دو ژن در دستگاه قرار داده و تکثیر شد.
توالی پرایمرهای 5-3 استفاده شده برای تکثیر ژنهای UCA1 ,AKT و GAPDH در
جدول شماره 1 آورده شده:
واکنشها برای حجم μl 25 تنظیم شدند. 12/5 µl مستر میکس سایبرگرین، 1 µl از هر یک از پرایرهای رفت و برگشت، 2 µl از cDNA و 8/5 µl از آب دوبار تقطیر را مخلوط کرده و در برنامه زمانی دناتوراسیون اولیه، در دمای 95°C به مدت ده دقیقه و قطعات DNA در چهل سیکل (دناتوراسیون C°95 پنج ثانیه، اتصال 8/8، سی ثانیه برای UCA1 وAKT، بسط و گسترش °C72، 30 ثانیه) تکثیر یافتند.(مراحل کار برای هر ژن سه مرتبه تکرار شد.)
بررسی تأیید حضور ژن وآنالیز آماری: جهت تایید حضور ژن از روش محصول PCR با الکتروفوز روی ژل آگارز 2 درصد استفاده شده و طول قطعات برابر با pb300 مشاهده شد. سپس در شرکت ژن فن آواران در یک جهت مستقیم، تعیین توالی شده و مورد تأیید قرارگرفت. پس از واکنش تفاوت ct ژن هدف به ژن رفرنس به صورت برای هر نمونه محاسبه شد. سپس برای هر نمونه به دست آمد (در
جداول شماره 2 و
3 آورده شده است). برای بررسی بیان ژنهای UCA1 وAKT، توسط روش Real time PCR روش لیواک (Livak Method) [
31] و برنامه Rest (2009) استفاده شد. P<0/05 به عنوان سطح معنادار در نظر گرفته شد.
یافتهها
با توجه به مقایسه ژن مرجع در گروههای تیمار و مشاهده محاسبه ضریب همبستگی و انحراف معیار که یکسان بودن اعداد -ct2 و Ratio را نشان داد، حاکی از عدم تأثیرپذیری ژن مرجع از دارو بود.
تغییرات بیان ژن UCA1 در زمانهای متفاوت تیمار داروی 6mp:
در بررسی تغییرات بیان ژن UCA1 در تیمار با داروی 6mp زمان 24 ساعت یافتهها نشان دادند که پس از تیمار با دارو در غلظتهای 1، 5 و 10و 25 ماکرومولار زمان 24 ساعت، کاهش بیان داشتیم که این کاهش به صورت معنادار (001/P<0) مشاهده شد و این کاهش در غلظتهای 1 (0/882)، 5 (0/499)، 10 (0/247) و 25 ماکرومولار (0/164) است. در زمان 48 ساعت در همه غلظتهای (1، 5، 10، 25 ماکرومولار) از داروی 6MP در سلولهای 1-Jurkat E6 تغییرات بیان به صورت افزایش معنادار مشاهده شد و در مدت زمان 72 ساعت طی آنالیزهای آماری بیان ژن UCA1 در سلولهای این گروه نسبت به سلولهای گروه کنترل پس از تیمار با داروی 6MP در تمام غلظتهای 1، 5، 10، 25 ماکرومولار افزایش بیان ژن مشاهده شد که از نظر آماری معنادار بود (
تصویر شماره 1).
تغییرات بیان ژن UCA1 در غلظتهای متفاوت تیمار داروی 6mp:
بیان ژن UCA1 نسبت به ژن کنترل در غلظت 1 ماکرومولار زمان 24 ساعت کاهش بیان داشته که به صورت معنادار بوده و در زمانهای 48 و 72 ساعت میزان بیان ژن نسبت به ژن کنترل به صورت معنادار افزایش یافته است. بیان ژن نسبت به ژن کنترل در غلظت 5 ماکرومولار زمان 24 ساعت به صورت کاهش معنادار مشاهده شد و در زمانهای 48 و72 ساعت میزان بیان ژن نسبت به کنترل افزایش بیان داشته که این افزایش به صورت معنادار بوده است. بیان ژن نسبت به ژن کنترل در غلظت 10 ماکرومولار در 24 ساعت کاهش یافته و از لحاظ آماری معنادار نیز بوده است و در زمانهای 48 و 72 ساعت میزان بیان ژن نسبت به ژن کنترل افزایش بیان داشته که از نظر آماری به صورت معنادار است. بیان ژن نسبت به ژن کنترل در غلظت 25 ماکرومولار در زمان 24 ساعت به صورت معنادار کاهش یافته و در زمانهای 48 و 72 ساعت میزان بیان ژن نسبت به ژن کنترل به صورت معنادار افزایش یافته است (
تصویر شماره 1).
تغییرات بیان ژن AKT در زمانهای متفاوت تیمار داروی 6MP: در بررسی تیمار داروی 6MP در رده سلولی 1-Jurkat E6 یافتهها نشان دادند که در مدت زمان 24 ساعت و در همه غلظتهای 1، 5، 10 و 25 ماکرومولار در سلولهای این گروه نسبت به سلولهای گروه کنترل پس از تیمار با دارو تغییرات بیان به صورت افزایش معنادار مشاهده شد. در مدت زمان 48 ساعت در غلظت μM1 از داروی6mp تغییرات بیان به صورت افزایش معنادار بوده و در غلظتهای 5، 10 و 25 ماکرومولار زمان 48 ساعت بیان ژن به صورت کاهش معنادار مشاهده شد و این کاهش در غلظتهای 5 ماکرومولار (0/755)، 10 ماکرومولار (0/443) و 1-25 ،Jurkat E6 ماکرومولار (0/373) است. در مدت زمان 72 ساعت در غلظتهای 1 ماکرومولار (0/319)، 5 ماکرومولار (0/193)، 10 ماکرومولار (0/093) و 25 ماکرومولار (0/014) طی آنالیزهای آماری بیان ژن AKT در سلولهای این گروه نسبت به سلولهای گروه کنترل پس از تیمار با 6mp، به صورت معنادار (P<0/001) کاهش یافته است (
تصویر شماره 1).
تغییرات بیان ژن AKT در غلظتهای متفاوت تیمار داروی 6mp: بیان ژن نسبت به ژن کنترل در غلظت 1 ماکرومولار زمانهای 24 و 48 ساعت به صورت افزایش بیان معنادار بوده و در زمان 72 ساعت میزان بیان ژن نسبت به ژن کنترل به صورت معنادار کاهش یافته است. بیان ژن نسبت به ژن کنترل در غلظت 5 ماکرومولار زمان 24 ساعت به صورت افزایش معنادار مشاهده شد و در زمانهای 48 و 72 ساعت میزان بیان ژن نسبت به کنترل کاهش بیان داشته که این کاهش از لحاظ آماری به صورت معنادار بوده است. بیان ژن نسبت به ژن کنترل در غلظت 10 ماکرومولار در زمان 24 ساعت افزایش بیان معنادار داشته و در زمانهای 48 و 72 ساعت کاهش بیان داشته که این کاهش از لحاظ آماری نیز معنادار بوده است. بیان ژن AKT نسبت به ژن کنترل در غلظت 25 ماکرومولار دارو در زمان 24 ساعت به صورت معنادار افزایش یافته است و در زمانهای 48 و 72 ساعت کاهش بیان داشته که این کاهش به صورت معنادار است (
تصویر شماره 1).
تغییرات بیان ژن UCA1 در زمانهای متفاوت تیمار با کمپلکس تیوسمی کاربازون نیکل: در مدت زمان 24 ساعت تیمار با داروی تیوسمی کاربازون طی آنالیزهای آماری بیان ژن UCA1، در سلولهای این گروه نسبت به سلولهای گروه کنترل پس از تیمار با دارو در تمام غلظتها بیان ژن به صورت معنادار افزایش یافته است. در مدت زمان 48 ساعت نیز در تمام غلظتهای 5/0، 1، 2، 5 ماکرومولار از داروی تیوسمی کاربازون در سلولهای 1-Jurkat E6، تغییرات بیان به صورت افزایش معنادار مشاهده شد و در مدت زمان 72 ساعت در غلظتهای 0/5 و 1 ماکرومولار از داروی تیوسمی کاربازون، تغییرات بیان به صورت افزایش معنادار و در غلظتهای 2 (0/388)و 5 ماکرومولار (0/180) کاهش بیان مشاهده شد که از نظر آماری معنادار (P<0/001) بود (
تصویر شماره 2).

تغییرات بیان ژن UCA1 در غلظتهای متفاوت تیمار کمپلکس تیوسمی کاربازون نیکل: بیان ژن نسبت به ژن کنترل در غلظت 0/5 ماکرومولار زمانهای 24، 48 و 72ساعت به صورت افزایش معنادار مشاهده شد. در غلظت 1 ماکرومولار زمانهای 24، 48 و 72 ساعت نیز میزان بیان ژن نسبت به ژن کنترل افزایش معنادار داشته و بیان ژن در غلظت 2 ماکرومولار در 24 و 48ساعت افزایش یافته و در 72 ساعت به صورت کاهش معنادار بوده است. بیان ژن نسبت به ژن کنترل، در غلظت 5 ماکرومولار زمانهای 24 و 48ساعت افزایش معنادار داشته و در زمان72 ساعت میزان بیان ژن به صورت معنادار کاهش یافته است (
تصویر شماره 2).
تغییرات بیان ژن AKT در زمانهای متفاوت تیمار با کمپلکس تیوسمی کاربازون نیکل: در مدت زمان 24 ساعت و در غلظتهای 0/5 ماکرومولار (0/733)، 1 ماکرومولار (0/722)، 2 ماکرومولار (0/407) و 5 ماکرومولار (0/270) طی آنالیزهای آماری بیان ژن AKT، در سلولهای این گروه نسبت به سلولهای گروه کنترل پس از تیمار با داروی Ni به صورت معنادار کاهش یافته است. در مدت زمان 48 ساعت در غلظتهای 0/5 و 1 ماکرومولار از داروی تیوسمی کاربازون تغییرات بیان به صورت افزایش معنادار و در غلظتهای 2 ماکرومولار (0/586) و 5 ماکرومولار (0/370) بیان ژن به صورت معنادار کاهش یافته است.
تغییرات بیان ژن AKT در مدت زمان 72 ساعت در غلظتهای 0/5 و 1 ماکرومولار بیان ژن به صورت افزایش معنادار و در غلظتهای 2 ماکرومولار (0/711) و 5 ماکرومولار (0/450) طی آنالیزهای آماری بیان ژن AKT، در سلولهای این گروه نسبت به سلولهای گروه کنترل پس از تیمار با داروی Ni به صورت معنادار (P<0/001) کاهش یافته است (
تصویر شماره 2).
تغییرات بیان ژن AKT در غلظتهای متفاوت تیمار با کمپلکس تیوسمی کاربازون نیکل: تغییرات غلظت 0/5 ماکرومولار دارو در زمانهای 24، 48 و 72 ساعت نشان داد که بیان ژن نسبت به ژن کنترل در غلظت 0/5 ماکرومولار زمان 24 ساعت به صورت کاهش بیان معنادار بوده و در زمانهای 48 و 72 ساعت میزان بیان ژن نسبت به ژن کنترل به صورت معنادار افزایش یافته است. بیان ژن نسبت به ژن کنترل، در غلظت 1 ماکرومولار زمان 24 ساعت به صورت کاهش معنادار مشاهده شد و در زمانهای 48 و 72 ساعت میزان بیان ژن نسبت به کنترل افزایش بیان به صورت معنادار بوده است. تعییرات بیان ژن AKT در غلظت 2 ماکرومولار در تمام زمانهای 24 و 48 و 72 ساعت به صورت کاهش معنادار مشاهده شد و بیان ژن نسبت به ژن کنترل در غلظت 5 ماکرومولار نیز در زمانهای 24 و 48 و 72 ساعت میزان بیان ژن نسبت به ژن کنترل به صورت معنادار کاهش یافته است (
تصویر شماره 2).
بررسی همزمان تغییرات بیان ژنهایUCA1 و AKT تحت تیمار با داروی 6mp و کمپکسهای تیوسمی کاربازون نیکل:
در آنالیز زمان ثابت در زمانهای 24، 48 و 72 ساعت طی بررسی تغییرات بیان ژنهای UCA1 وAKT تحت تیمار با داروی 6mp در زمان 24 ساعت افزایش بیان مشاهده شد که از نظر آماری معنادار بود و در زمانهای 48 ساعت (0/906) و 72 ساعت (0/401) طی آنالیزهای آماری بررسی تغییرات بیان ژنهای UCA1 وAKT کاهش بیان معنادار مشاهده شد و در بررسی تغییرات بیان ژنهای UCA1 و AKT تحت تیمار با داروی 6mp در آنالیز غلظت ثابت در غلظتهای 1 و 5 ماکرومولار افزایش بیان معنادار مشاهده شد و در غلظتهای 10 ماکرومولار (0/363) و 25 ماکرومولار (0/172) کاهش بیان مشاهده شد که از نظر آماری معنادار بود.
در بررسی تغییرات بیان ژنهای UCA1 وAKT تحت تیمار با داروی تیوسمی کاربازون (NI) در آنالیز زمان ثابت در تمام زمانهای 24، 48 و 72 ساعت افزایش بیان مشاهده شد که از نظر آماری معنادار نبود و در آنالیز غلظت ثابت در غلظتهای 0/5، 1 و 2 ماکرومولار نیز افزایش بیان مشاهده شد که از لحاظ آماری معنادار نبود و در غلظت 5 ماکرومولار (0/599)کاهش بیان داشتیم که از لحاظ آماری معنادار بود.
بحث
در مطالعه فوق داروی 6mp تأثیر بیشتری بر ژن UCA1 داشته و در ژن AKT تیوسمی کاربازون تأثیر بالایی روی بیان ژن ایفا میکند و همچنین ژن UCA1 روی ژن هدف AKT تأثیر داشته و در سرطان با فعالسازی این ژن سبب تکثیر و پیشروی لوسمی میشود. پس از تیمار با داروهای تیوسمی کاربازون و 6mp بیان ژنهای مورد بررسی کاهش یافته و سرطان مهار میشود.
طبق مطالعه زهنو بییان و همکاران در جهت بررسی نقش و سازوکارهای UCA1 در CRC ژن UCA1 درکاهش اپوپتوز و پیشرفت تومور نقش دارد. این مطالعه نشان داد که UCA1 انکوژن جدید بوده و در سرطانی شدن سلول ایفای نقش میکند. گانگ و همکاران نیز تحقیقاتی روی ژن UCA1 در سرطان معده انجام دادند. طبق نتایج آنها UCA1 در بافتهای سرطانی معده به طرز شگرفی افزایش یافته و بهطور قابلتوجهی با متاستاز عده لنفاوی همراه است. همچنین سطح بیان ZEB2 که یک فاکتور رونویسی مربوط به متاستاز تومور است نیز توسط UCA1 تنظیم میشود.
در مطالعهای که توسط یااو روی سرطان مثانه انجام شد نیز UCA1 در سرطانهای مختلف افزایش بیان داشته و تومورزایی را عمدتاً از طریق اتصال به میکرو RNAهای سرکوبگر تومور (miRNAها)، فعال کردن چندین مسیر سیگنالی مهم، تغییر تنظیمات اپیژنتیک و رونویسی ترویج میکند. در پژوهش کنونی نیز UCA1 به عنوان یک انکوژن عمل کرده و میزان بیان آن در لوسمی به شدت افزایش یافته و اپوپتوز را کاهش داده و با تکثیرسلولی باعث پیشبرد سرطان میشود. همچنین به عنوان یک نشانگر تشخیصی برای سرطان خون تلقی میشود، بیان این ژن پس از تیمار با داروهای 6mp و تیوسمی کاربازون کاهش مییابد و تکثیر سلولی مهار میشود [
32].
دو و لا تحقیقاتی در رابطه با بررسی نقش بالقوه سیگنالینگ AKT در بیماریهای مزمن کلیوی انجام دادند. بنا به گزارشهای آنها خانواده AKT نقش مهمی در تنظیم رشد، تکثیر، بقا، متابولیسم و دیگر فعالیتهای سلولی بازی میکنند و فعالسازی AKT یک نقطه مهم در سرطانی شدن سلول و ایجاد تومور به حساب میآید [
33].
ریواتیدوی نیز به بررسی ژن AKT در سرطان پرداخت. طبق این مطالعه Akt را میتوان با طیف گستردهای از سیگنالهای رشد فعال کرد. پس از فعالسازی، این ژن عملکرد بسیاری از پروتئینهای پایین دست درگیر در بقای سلولی، تکثیر، مهاجرت، متابولیسم و آنژیوژنز را تنظیم میکند و این ژن در سرطانهای انسانی تنظیم میشود [
34].
سانگ و همکاران ژن AKT را درسرطان بررسی کردند. AKT نقش مهمی در مسیرهای سیگنالینگ PI3K / AKT ایفا کرده و فعال شدن و بیان غیرطبیعی AKT در بسیاری از سرطانها، ازجمله سرطان تخمدان، ریه و لوزالمعده مشاهده شده و با افزایش تکثیر سلولهای سرطانی و بقا همراه است [
35].
در پژوهش کنونی نیز AKT در توالیهای مختلف سیگنالینگ درگیر در لوسمی دخیل بوده و با افزایش بیان سلول را به سمت سرطانی شدن پیش میبرد و فعالیت آن پس از تیمار با مهارکنندههای مورد استفاده در تحقیق مانند تیوسمی کاربازون و 6mp کاهش یافته و سرطان مهار میشود [
35].
ریس و همکاران با اجرای تست MTT، روی کمپلکسهای تیوسمی کاربازون روی لاینهای سلولی لوسمی انسانی تحقیقاتی انجام دادند و میزان کشندگی این ترکیبات را بررسی کردند. این ترکیبات بر سلولهای سرطانی نقش مهاری داشته و میزان کشندگی بالایی از خود نشان دادند. در تحقیق کنونی نیز ما با انجام تست MTT و یافتن دُز مؤثر داروی تیوسمی کاربازون و مرکاپتوپورین اثر کشندگی آنها را روی سلولهای لوسمی بررسی کردیم که این ترکیبات بیان سلولهای ما را کاهش داده و میزان کشندگی بالایی از خود نشان دادند و میزان بیان ژنهای UCA1 و AKT پس از تیمار با داروهای 6mp و تیوسمی کاربازون کاهش چشمگیری داشت [
36].
بر اساس یافتههای حاصل از بررسی ارتباط بین تغییرات بیان lncRNAهای UCA1 و AKT تحت تیمار با داروی 6mp در زمانهای اثرکرد 48 و 72 ساعت و در غلظتهای 10 و μM25 و در تیمار با داروی تیوسمی کاربازون در غلظت μM5 با یکدیگر در ارتباط هستند. در تیمار ژن UCA1 با داروی 6mp اثرکرد دارو در زمان 24 ساعت بیشترین میزان کاهش بیان را ایجاد کرده و با گذر زمان اثرکرد دارو کاهش مییابد، اما افزایش غلظت تأثیر مثبتی روی بیان ژن داشته و بیشترین میزان کاهش بیان در غلظت 25 ماکرومولار زمان 24 ساعت با میزان 0/164 تأیید شد.
در تیمار ژن AKT با داروی 6mp اثرکرد دارو با گذر زمان و افزایش غلظت بیشتر شده و بیشترین میزان تعییرات بیان در زمان 72 ساعت و غلظت 25 ماکرومولار با میزان 014/0 مشاهده شد. در تیمار با داروی تیوسمی کاربازون در ژن UCA1 نیز با گذشت زمان و افزایش غلظت اثرکرد دارو افزایش یافته و بیشترین میزان تغییرات بیان در غلظت 5 ماکرومولار زمان 72 ساعت با میزان 0/180 مشاهده شد و در تیمار این دارو با ژن AKT افزایش غلظت تأثیر مثبتی روی بیان ژن داشته و بیشترین میزان کاهش بیان در غلظت 5 ماکرومولار زمان 24 ساعت با میزان 27/0 مشاهده شد و گذر زمان نتیجه مطلوبی روی بیان این ژن ندارد.
در بررسی همزمان تغییرات بیان ژنهای UCA1 و AKT تحت تیمار با داروی 6mp بیشترین میزان کاهش بیان ژن مربوط به 72 ساعت از دارو با میزان 0/401 و در آنالیز غلظت ثابت بیشترین میزان کاهش بیان مربوط به غلظت 25 ماکرومولار با میزان 0/172 است و در بررسی همزمان تغییرات بیان ژنهای UCA1 و AKT تحت تیمار با داروی Ni بیشترین میزان کاهش بیان ژن مربوط به غلظت 5 ماکرومولار از دارو با میزان 0/599 است.
در مقایسه بررسی اثرکرد هر دو دارو، داروی 6mp اثرکرد بیشتری بر ژن UCA1 داشته و باعث کاهش بیان در تمام غلظتهای این ژن در زمان 24 ساعت میشود، اما داروی تیوسمی کاربازون تنها در دو غلظت از زمان 72 ساعت باعث کاهش بیان این ژن میشود و در ژن AKT داروی تیوسمی کاربازون اثرکرد بیشتری در میزان بیان این ژن داشته و در هر سه زمان کاهش بیان ژن مشاهده شد، اما در تیمار با 6mp فقط در زمانهای 48 و 72 ساعت اثرکرد ژن کاهش یافته و دارو در زمان 24 ساعت هیچ تأثیری روی بیان ژن ایجاد نمیکند.
نتیجهگیری
در بررسی دُز موثر داروهای مورد استفاده (6mp و تیوسمی کاربازون) توسط آزمون MTT گروه تیمار با غلظتهای 1، 5، 10، 25 ماکرومولار از داروی 6mp و غلظتهای 1، 2، 5، 0/5 ماکرومولار از داروی Ni (تیوسمی کاربازون) تهیه شد. از نمونه CTهای بهدستآمده برای ژن UCA1 در تیمار با داروی 6mp در غلظت 1 ماکرومولار میتوان به 26/1-26/6-27/2 و در تیمار با داروی Ni در غلظت 0/5 ماکرومولار میتوان به 29/1-29/7-30/2 اشاره کرد و در ژن AKT در تیمار با داروی 6mp در غلظت 1 ماکرومولار 30/3-31/2-31/7 و در تیمار با داروی Ni در غلظت 0/5 ماکرومولار 34/1-34/6- 35/3 به دست آمد.همچنین melte curve مربوط به هریک از ژنها در
تصاویر شماره 3 و
4 آورده شده است.


ژنهای UCA1 و AKT تحت تیمار با داروی 6mp در غلظت 25 ماکرومولار بیشترین تأثیر را روی سلولها نشان دادند، درنتیجه غلظت بهینه برای داروی 6mp غلظت 25 ماکرومولار است و همچنین در تیمار با داروی 6mp در زمان 72 ساعت نیز بیشترین تأثیر را روی سلول ها نشان دادند، درنتیجه زمان بهینه برای داروی 6mp زمان 72 ساعت است. در تیمار با داروی تیوسمی کاربازون در غلظت 5 ماکرومولار بیشترین تأثیر روی سلولهای سرطان مشاهده شد، درنتیجه غلظت بهینه برای داروی تیوسمی کاربازون غلظت 5 ماکرومولار است و طبق نتایج بهدستآمده ژنهای UCA1 و AKT با یکدیگر در ارتباط بوده و روی یکدیگر اثر متقابل ایفا میکنند.
طبق مطالعه فوق UCA1 و AKT به عنوان ژنهای کلیدی در ایجاد سرطان خون دخیل بوده و پس از تیمار با داروهای تیوسمی کاربازون و 6mp میزان بیان این ژنها در سلول سرطان خون کاهش مییابد و لوسمی مهار میشود.
موارد زیر جزو پیشنهادات تحقیق برای آینده هستند:
1. بررسی ژنهای UCA1 و AKT در سایر مسیرهای سیگنالی دخیل در سرطان خون؛
2. بررسی ژنهای UCA1 و AKT تحت تیمار با سایر داروهای شیمی درمانی؛
3. بررسی سایر ژنهای مسیر سیگنالی PI3K / AKT در سرطان خون؛
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این تحقیق بر روی رده سلولهای سرطانی لوسمی حاد لنفوبلاستیک تهیهشده از بانک سلولی انجام شده است و از هیچگونه نمونه انسانی یا حیوانی زنده استفاده نشده است.
حامی مالی
این مقاله برگرفته از پایاننامه کارشناسی ارشد نویسنده اول در گروه ژنتیک، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد زنجان، زنجان است. همچنین این پژوهش با همکاری مرکز علوم تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی زنجان، انستیتو پاستور ایران و با حمایت دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی زنجان انجام شد.
مشارکت نویسندگان
مفهومسازی، تحلیل، نظارت و مدیریت پروژه: گلناز اسعدی تهرانی؛ تحقیق و بررسی: گلناز اسعدی تهرانی، فرانک دانشی و آزاده میرزا احمدی؛ نگارش پیشنویس: فاطمه قربانی و فرانک دانشی؛ ویراستاری و نهاییسازی نوشته: گلناز اسعدی تهرانی.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
Refrences
- Cooper SL, Brown PA. Treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Pediatr Clin North Am. 2015; 62(1):61-73. [DOI:10.1016/j.pcl.2014.09.006] [PMID] [PMCID]
- Gaynon PS, Angiolillo AL, Carroll WL, Nachman JB, Trigg ME, Sather HN, et al. Long-term results of the children’s cancer group studies for childhood acute lymphoblastic leukemia 1983–2002: A children’s oncology group report. Leukemia. 2010; 24(2):285-97. [DOI:10.1038/leu.2009.262][PMID][PMCID]
- Inaba H, Greaves M, Mullighan CG. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet. 2013; 381(9881):1943-55. [DOI:10.1016/S0140-6736(12)62187-4]
- Vrooman LM, Silverman LB. Treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia: prognostic factors and clinical advances. Curr Hematol Malig Rep. 2016; 11(5):385-94. [DOI:10.1007/s11899-016-0337-y]
- Bongiovanni D, Saccomani V, Piovan E. Aberrant signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Int J Mol Sci. 2017; 18(9):1904. [DOI:10.3390/ijms18091904][PMID][PMCID]
- Belver L, Ferrando A. The genetics and mechanisms of T cell acute lymphoblastic leukaemia. Nat Rev Ca 2016; 16(8):494-507. [DOI:10.1038/nrc.2016.63][PMID]
- Weng AP, Ferrando AA, Lee W, Morris JP, Silverman LB, Sanchez-Irizarry C, et al. Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia. Science. 2004; 306(5694):269-71. [DOI:1126/science.1102160][PMID]
- Askari R, Ranjbar M, Nakhaeizadeh M, Sheikholeslami S, Sepehrifar S, Adhami M, e al. Survival rate of patients with acute leukemia in Iran: A systematic review and meta-analysis. Evid Based Health Policy Manag and Econ. 2018; 2(4):281-9. [DOI:10.18502/jebhpme.v2i4.280]
- Berninghausen O, Leippe M. Necrosis versus apoptosis as the mechanism of target cell death induced by Entamoeba histolytica. Infect Immun. 1997; 65(9):3615-21. [DOI:10.1128/iai.65.9.3615-3621.1997][PMID][PMCID]
- Lu M, Wang J, Ives HE, Pearce D. mSIN1 protein mediates SGK1 protein interaction with mTORC2 protein complex and is required for selective activation of the epithelial sodium channel. J Biol Chem. 2011; 286(35):30647-54. [DOI:10.1074/jbc.M111.257592][PMID][PMCID]
- Micale MA. Pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2018; (11). [DOI:10.4267/2042/68970]
- Vivanco I, Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-kinase–AKT pathway in human cancer. Nat Rev Cancer. 2002; 2(7):489-501. [DOI:10.1038/nrc839][PMID]
- Osaki M, Oshimura MA, Ito H. PI3K-Akt pathway: Its functions and alterations in human cancer. Apoptosis. 2004; 9(6):667-76. [DOI:10.1023/B:APPT.0000045801.15585.dd][PMID]
- Hill MM, Hemmings BA. Inhibition of protein kinase B/Akt: Implications for cancer therapy. Pharmacol Ther. 2002; 93(2-3):243-51. [DOI:10.1016/S0163-7258(02)00193-6]
- Nicholson KM, Anderson NG. The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy. Cell Signal. 2002; 14(5):381-95. [DOI:10.1016/S0898-6568(01)00271-6]
- Shukla S, MacLennan GT, Hartman DJ, Fu P, Resnick MI, Gupta S. Activation of PI3K-Akt signaling pathway promotes prostate cancer cell invasion. Int J Cancer. 2007; 121(7):1424-32. [DOI:10.1002/ijc.22862][PMID]
- Ma L, Bajic VB, Zhang Z. On the classification of long non-coding RNAs. RNA Biol. 2013; 10(6):925-33. [DOI:10.4161/rna.24604][PMID][PMCID]
- Clark MB, Mattick JS. Long noncoding RNAs in cell biology. Semin Cell Dev Biol. 2011; 22(4):366-76 [DOI:10.1016/j.semcdb.2011.01.001][PMID]
- Ponting CP, Oliver PL, Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs. Cell. 2009; 136(4):629-41. [DOI:10.1016/j.cell.2009.02.006][PMID]
- Ransohoff JD, Wei Y, Khavari PA. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018; 19(3):143-57. [DOI:10.1038/nrm.2017.104][PMID][PMCID]
- Wapinski O, Chang HY. Long noncoding RNAs and human disease. Trends Cell Biol. 2011; 21(6):354-61. [DOI:10.1016/j.tcb.2011.04.001][PMID]
- Edgar R, Domrachev M, Lash AE. Gene expression omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Res. 2002; 30(1):207-10. [DOI:10.1093/nar/30.1.207][PMID][PMCID]
- Huang J, Zhou N, Watabe K, Lu Z, Wu F, Xu M, et al. Long non-coding RNA UCA1 promotes breast tumor growth by suppression of p27 (Kip1). Cell Death Dis. 2014; 5(1):e1008. [DOI:10.1038/cddis.2013.541][PMID][PMCID]
- Wang H, Guan Z, He K, Qian J, Cao J, Teng L. LncRNA UCA1 in anti-cancer drug resistance. Oncotarget. 2017; 8(38):64638-50. [DOI:10.18632/oncotarget.18344][PMID][PMCID]
- Ke Z, Tang R, Tan J, Jiang Z, Liang Z, Feng S. [Clinical observation of clarithromycin treatment for nasosinusitis after nasopharyngeal carcinoma radiotherapy (Chinese)]. Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi. 2010; 24(7):299-300. [PMID]
- Li C, Liang G, Yang S, Sui J, Yao W, Shen X, et al. Dysregulated lncRNA-UCA1 contributes to the progression of gastric cancer through regulation of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Oncotar 2017; 8(55):93476-91. [DOI:10.18632/oncotarget.19281][PMID][PMCID]
- Qin L, Jia Z, Xie D, Liu Z. Retracted: Knockdown of long noncoding RNA urothelial carcinoma–associated 1 inhibits cell viability, migration, and invasion by regulating microRNA-182 in gastric carcinoma. J Cell Biochem. 2018; 119(12):10075-86. [DOI:10.1002/jcb.27344][PMID]
- Ghiam AF, Taeb S, Huang X, Huang V, Ray J, Scarcello S, et al. Long non-coding RNA urothelial carcinoma associated 1 (UCA1) mediates radiation response in prostate Oncotarget. 2017; 8(3):4668-89. [DOI:10.18632/oncotarget.13576][PMID][PMCID]
- Marill JL, Miller N, Kitendaugh P. The MedlinePlus public user interface: Studies of design challenges and opportunities. J Med Libr Assoc. 2006; 94(1):30-40. [PMCID]
- Sun J, Zhao R, Zeng J, Li G, Li X. Characterization of destrins with different dextrose equivalents. Molecules. 2010; 15(8):5162-73. [DOI:10.3390/molecules15085162][PMID][PMCID]
- Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001; 25(4):402-8. [DOI:10.1006/meth.2001.1262][PMID]
- Yao F, Wang Q, Wu Q. The prognostic value and mechanisms of lncRNA UCA1 in human cancer. Cancer Manag Res. 2019; 11:7685-96. [DOI:10.2147/CMAR.S200436][PMID][PMCID]
- Lan A, Du J. Potential role of Akt signaling in chronic kidney disease. Nephrol Dial Transplant. 2015; 30(3):385-94. [DOI:10.1093/ndt/gfu196][PMID]
- Revathidevi S, Munirajan AK. Akt in cancer: Mediator and more. Semin Cancer Biol. 2019; 59:80-91. [DOI:10.1016/j.semcancer.2019.06.002][PMID]
- Song M, Bode AM, Dong Z, Lee MH. AKT as a therapeutic target for cancer. Cancer Res. 2019; 79(6):1019-31. [DOI:10.1158/0008-5472.CAN-18-2738][PMID]
- Reis DC, Pinto MC, Souza-Fagundes EM, Wardell SM, Wardell JL, Beraldo H. Antimony (III) complexes with 2-benzoylpyridine-derived thiosemicarbazones: Cytotoxicity against human leukemia cell lines. Eur J Med Chem. 2010; 45(9):3904-10. [DOI:10.1016/j.ejmech.2010.05.044][PMID]