نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران
چکیده
کلیدواژهها
مقدمه
سراشیا از خانواده آنتروباکتریاسه و یک باکتری گرم منفی، بیهوازی اختیاری، متحرک و اکسیداز مثبت دارای رنگدانه است که در آبهای شیرین حضور دارد. این باکتری از عفونتهای ریوی ـ ادراری و خونی قابل جداسازی است. کشت این باکتری بوی ماهی یا ادرار میدهد و در محیطهای آزمایشگاهی بهخوبی پرورش مییابد. سراشیا مارسسنس از گونههای معروف سراشیاست و و اهمیت بالایی دارد و در شرایط اتاق قادر به تولید رنگیزه است [1]. از خصوصیت پیگمانزایی سراشیا مارسنس به عنوان مارکر ذرات غبار در محیط و در بیمارستان استفاده میشود. امروزه رنگدانههای زیستی در تهیه و تولید محصولات دارویی بهوفور مورد استفاده قرار میگیرند. با توجه به اهمیت کاربردی رنگدانههای زیستی، بهینهسازی شرایط تولید آنها در حد بالاتر پیشنهاد میشود [2 ,3]. یکی از مهمترین آنها رنگدانه قرمز تری پیرولی سراشیا مارسسنس به نام Prodigiosin است که به دلیل فعالیتهای ضدقارچی، ضدسرطانی، ضدمالاریا، سرکوبکنندگی پاسخ ایمنی و فعالیت ضدپرولیفراسیون، ترکیبی امیدوارکننده در صنعت داروسازی است [4 ,5]. این ماده اخیراً به سبب توانایی آن در ماشهکشی آپوپتوز در سلولهای سرطانی، به روشی پیچیده شامل مهار فسفاتاز، برش ساختار دورشتهای DNA و یا ایجاد اختلال در شیب pH موجود در غشا، مورد توجه قرار گرفته است. همچنین به عنوان یک ماده رنگی و رنگکننده کاربرد دارد [6, 7]. این رنگدانه یک متابولیت ثانویه ویژه محسوب میشود [6] و تولید آن تنها در درصد کمی از ایزولهها مشاهده میشود [3، 8]. در مطالعه حاضر از طریق روش T-A، کلونینگ تولید این رنگدانه در باکتری Ecoli XL1blue به انجام رسیده و تأیید انجام فرایند کلونینگ توسط سنجش میزان بیان ژن مورد نظر ارزیابی شده است. همچنین از طریق رسم درخت فیلوژنتیکی، خویشاوندان نزدیک باکتری سراشیا مارسنس جهت مطالعات آینده برای بهینهسازی فرایند تولید رنگیزه پرودی جیوسین معرفی شدهاند.
روش بررسی
نمونهبرداری
صد نمونه از منابع بالینی بیماران بستری دارای عفونت ادراری در بیمارستانهای مختلف ساوه جداسازی و به صورت استریل به آزمایشگاه میکروبشناسی منتقل شد.
تعیین هویت جدایههای باکتریایی مشکوک به سراشیا از طریق روشهای بیوشیمیایی و مورفولوژیکی
بررسیهای ماکروسکوپی، میکروسکوپی و تستهای بیوشیمیایی شامل رنگآمیزی گرم، تست کاتالاز و اکسیداز و استفاده از محیطهای افتراقی مانند TSI، SIM، MRVP و سیمون سیترات، فینل آلانین آگار و اوره و نیز تستهای تکمیلی مانند تخمیر قندها و استفاده از آمینواسیدها، جهت شناسایی گونه سراشیا مارسنس انجام شد. همچنین توانایی تولید رنگدانه پرودی جیوسین که اختصاصی اینگونه است، از طریق مشاهده رنگ قرمز در کلونیها، تایید شد.
تعیین هویت جدایههای باکتریایی مشکوک به سراشیا از طریق روشهای مولکولی
تأیید هویت مولکولی سراشیا مارسنس، توسط PCR ژن 16srRNA با استفاده از پرایمرهای ارائهشده در جدول شماره 1، به انجام رسید.
سپس محصول PCR به منظور سکانس برای شرکت Bioneer ارسال شد و نتیجه سکانس در پایگاه داده NCBI، BLASTشد.
• کلون کردن ژن رنگدانه پرودی جیوسین در باکتری Ecoli XL1blue
• شناسایی ژن pig توسط واکنش PCR
استخراج DNA باکتری توسط کیت استخراج مرکز ملی ذخایر ژنتیکی انجام شد. محصولات استخراجشده بر روی ژل آگارز 1/5درصد الکتروفورز شده سپس واکنش زنجیره پلیمراز با استفاده از پرایمرهای ژن پرودی جیوسین (جدول شماره 1) انجام شد. سویه سراشیا مارسنس تولیدکننده ژنهای موردنظر به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد.
TA Cloning
به منظور کلون کردن محصول PCR، از کیت PCR TA-Cloning شرکت سینا ژن استفاده شد. وکتور PTG19-T به عنوان ناقل، BamH1 به عنوان آنزیم محدودگر، و باکتری E.Coli سویه XL1blue به عنوان میزبان به کار گرفته شد. غربالگری ورود وکتور به میزبان توسط محیط دارای آمپیسیلین و شناسایی باکتریهای نوترکیب توسط غربالگری سفید ـ آبی در محیط IPTG-XGAL انجام شد. تأیید حضور ژن Pig درون کلونیهای سفید توسط انجام PCR با پرایمرهای M13و سپس تعیین توالی ناحیه مذکور و همچنین مقایسه طول محصولات PCR قبل و بعد از انجام فرایند کلونینگ انجام شد.
تعیین میزان بیان ژن پرودی جیوسین در باکتریهای نوترکیب حاصل با روش Real time PCR
به منظور تأیید کارایی فرایند کلونینگ، لازم است که بیان ژن کلونشده در کلونیهای حاصل مورد ارزیابی قرار گیرد. بدین منظور استخراج RNA توسط میکروکیت RNeasy (شرکت Qiagen) از سوسپانسیون باکتریایی کلونیهای سفید در فاز نمایی رشد (در 0/6-0/4 =OD600) انجام گرفت. سنتز CDNA با استفاده از آنزیم AMV Reverse Transcriptase و واکنش Real Time PCR با استفاده از کیت شرکت Genet bio کره جنوبی به انجام رسید. ژن خانهدار 16s به عنوان کنترل داخلی تست استفاده شد. آنالیز میزان بیان با اندازهگیری نسبی بیان mRNA در مقایسه با کنترل منفی که باکتری E.coli فاقد ژن پرودی جیوسین بود، انجام شد.
رسم درخت فیلوژنی
با استفاده از پرایمرهای ارائهشده در جدول شماره 1، PCR ژنهای 16srRNA، در دمای اتصال 55 درجه سانتیگراد و تعیین توالی در شرکت Bioneer انجام شد. توالیهای حاصله پس از بررسی در نرمافزار BioEdit، توسط DNA Baser مکملسازی شد. نتیجه با جدایههای ثبتشده در NCBI از طریق n Blast مقایسه شد و سپس در نرمافزار W Clustal همردیـف شدند. سپس با استفاده از برنامه 5-MEGA درختهای فیلوژنیک ترسیم شدند و با استفاده از روش الحـاق ترسـیم M در برنامه Neighbor Joining (روش پیوند همجوار NJ) همسایه شدند. پس از تعیین فواصـل نوکلوتیـدی بـهدسـتآمـده بـا استفاده از نرم افزار Excel، نمودار مربوطه رسم شد [9].
یافتهها
تعیین هویت جدایههای باکتریایی مشکوک به سراشیا از طریق روشهای بیوشیمیایی و مورفولوژیکی
نتایج کشت سلولهای سراشیا مارسنس در تصویر شماره 1 و نتایج مرتبط با ویژگیهای مورفولوژیکی، رنگآمیزی گرم و نتایج تستهای بیوشیمیایی در جدول شماره 2 ارائه شده است.
این یافتهها در جداسازی باکتری مورد نظر به کار گرفته شد. به طور کلی از نمونههای جمعآوریشده، بر اساس خصوصیات مورفولوژیک، میکروسکوپی و تستهای بیوشیمیایی، دوازده ایزوله سراشیا مارسنس جداسازی شد.
تعیین هویت جدایههای باکتریایی مشکوک به سراشیا از طریق روشهای مولکولی
فرایند BLAST انطباق توالی حاصل از تعیین توالی سنگر را با توالی رفرنس سراشیا مارسنس موجود در پایگاه داده NCBI تأیید کرد (تصویر شماره 2).
• کلون کردن ژن رنگدانه پرودی جیوسین در باکتری Ecoli XL1blue
• شناسایی ژن pig توسط واکنش PCR
در این مرحله از دوازده ایزوله سراشیا مارسنس جداسازیشده چهار سویه واجد ژن pig شناسایی شد (تصویر شماره 3).
وجود محصول PCR در ناحیه 334 جفت باز، نشاندهنده وجود ژن pig در باکتری مورد بررسی خواهد بود. در تصویر شماره 3، چهار ریکشن، تولید باند مربوط به ژن pig را به همراه داشتهاند.
• تولید کلونهای نوترکیب در T-A Cloning
حضور کلونیهای سفید و آبی در تصویر شماره 4 نشان داده شده است که موید وجود کلونیهای نوترکیب در محیط کشت IPTG-Xgal است.
نتیجه الکتروفورز ژل آگارز محصولات PCR تولیدشده توسط پرایمرهای M13، قبل و بعد از فرایند کلونینگ در تصویر شماره 5 ارائه شده است.
اختلاف طول این محصولات نیز مؤید ورود قطعه ژنی موردنظر به درون سلول است. همچنین تعیین توالی ناحیه اتصال وکتور ـ Insert نیز نشاندهنده انجام نوترکیب در سلول است (تصویر شماره 6).
بررسی میزان بیان ژن pig کلونشده توسط PCR Real time
نتایج استخراج RNA در تصویر شماره 7 نشان داده شده است.
همچنین منحنی سنتز Real Time PCR نیز در تصویر شماره 8 ارائه شده است.
همانطور که در این تصویر مشخص است، میزان بیان ژن pig در دو منحنی ایجادشده توسط E.coli اولیه (زرد) و E.coli بهکاررفته در کلونینگ ژن pig (سبز)، تفاوت چشمگیری نشان میدهد. به طوری که در نمودار زرد هیچ بیانی از ژن pig قابل مشاهده نیست و در عوض در نمودار سبزرنگ باکتری نوترکیب حاصل، میزان چشمگیری از پروتئین pig را تولید کرده است.
درخت فیلوژنی
نتایج الکتروفورز محصولات PCR با پرایمرهای عمومی 16srRNA در تصویر شماره 9 نشان داده شده است.
همچنین نتایج رسم درخت فیلوژنتیکی در تصویر شماره 9 ارائه شده است. نتـایج درخـت فیلوژنتیکی نشـان میدهـد کـه گونـههـای Seratia marcence بــا بــوت اســترپ 100 درصد و Seratia palmy uthica با بوت استرپ 100 درصد در یک کــلاد (خوشــه) قــرار گرفتنــد کــه بیــانگر رابطــه خویشاوندی نزدیک آنها با هم است (تصویر شماره 10).
این گونهها قادر هستند که به منظور تولید رنگدانه پرودی جیوسین در مطالعات آینده مورد استفاده قرار گیرند.
بحث
سراشیا، باکتری گرم منفی و متحرک و دارای کپسول کوچکی است و کلونیهای آن دارای رنگیزه سفید ـ صورتی و یا قرمز هستند. سراشیا مارسنس از گونههای معروف آن است و اهمیت بالایی دارد. پرودی جیوسین یک تری پیرول است و اولین بار در سراشیا مارسنس شناسایی شد که کلونیهای قرمز صندوقی شکل زیبایی را ایجاد میکند [10]. تولید رنگدانهها در درصد کمی از ایزولهها دیده میشود. مطالعات اخیر خواص ضدقارچی و ضدسرطانی این رنگدانه و اهمیت آن را در صنایع داروسازی نشان داده است. رنگدانههای تولیدشده توسط باکتریها کارایی زیادی به عنوان فراوردههای مهم دارویی دارند. به منظور افزایش توانایی باکتری در سنتز مقادیر زیادی رنگدانه، محیطهای مختلف، نقش دما، رشد میکروارگانیسم در محیطهای مختلف و تولید رنگدانه مورد مطالعه قرار گرفته است [8، 10]. یک محیط میتواند رشد باکتری را حمایت و تقویت کند و در زمانهای مشابه موجب افزایش سطح تولید رنگدانه شود. خنافری و همکاران، شرایط بهینه تولید رنگدانه پرودی جیوسین توسط سراشیا مارسنس را با روش اسپکتروفتومتری ماورای بنفش در طول موج 535 نانومتر بررسی کردند. به منظور خالصسازی رنگیزههای تولیدی از روش کروماتوگرافی ستونی استفاده شد. بهترین محیط کشت برای بیشترین میزان تولید این رنگدانه محیطهای peanut broth و Sesame seed broth و دمای 28 درجه سانتیگراد گزارش شد [11]. حسینیدوست و همکاران باکتریهای واجد فعالیت پروتئازی و رنگدانه پرودی جیوسین را از نمونههای جمعآوریشده از شالیزارهای مازندران جداسازی کردند. سپس وزن مولکولی آنزیمهای سراشیو پپتیداز تولیدشده در این باکتریها را توسط روش SDS-PAGE سنجیدند و ایزولههای تولیدکننده رنگدانه پرودی جیوسین را تعیین هویت کردند. وزن ملکولی آنزیم تقریباً 52kda برآورد شده، و بهترین محیط کشت برای بیشترین میزان تولید این رنگدانه، محیط کشت Skim milk broth و دمای 28 درجه سانتیگراد گزارش شد [12]. حسینی و همکاران رنگدانه قرمز پرودی جیوسین را از باکتری سراشیا استخراج کرده و سپس خاصیت ضدباکتریایی این ترکیب را در غلظتهای مختلف (0/07، 0/08 و 0/09 میلیلیتر) علیه باکتریهای سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس در محیط کشت آگار ارزیابی کردند. نتایج مطالعه خاصیت ضدباکتریایی این رنگدانه را تأیید کرد [13].
نورا و همکاران به بررسی تأثیر شرایط مختلف در تولید بهینهی انواع پروتئینهای باکتریایی از جمله رنگدانه مورد بحث پرداختند [2]. هادیکس و همکاران به مقایسه بازدهی هر دو روش کشت دستهای و روشهای رشد شیمیایی پرداخته و تأثیر رنگدانههای سراشیا را بر میزان تولید ATP در فازهای مختلف رشد باکتری بررسی کردند. نتایج حاصل از هر دو دسته کشت و chemostat نشان داد که سلولهای رنگدانه به عنوان دوغاب باکتری S. marcescens تقریباً دو برابر عملکرد زیست توده رشد میکنند و تولید پرودی جیوسین میتواند مزایای رشد را در دمای محیط فراهم کند [8]. این مطالعات از آن جهت که در جستوجوی شرایط بهینه و ارزان در تولید رنگدانه پرودی جیوسین هستند، با مطالعه حاضر همخوانی و انطباق دارند.
در مطالعهی انجامشده توسط داونهاور و همکاران، از روش کلونسازی T-A درون باکتری E.coli به منظور تولید رنگدانه پرودی جیوسین استفاده شد. در این مطالعه همانند آنچه در مطالعه حاضر انجام شد، میزان بیان ژن کدکننده رنگیزه مذکور به روش PCR مورد سنجش قرار گرفته است. نتایج این مطالعه به سبب آنکه میزان بیان ژن پرودی جیوسین را در باکتریهای دریافتکننده پلاسمید نوترکیب بیش از باکتریهای طبیعی اعلام کرده است، با مطالعه حاضر انطباق دارد. به عبارت دیگر محققان مذکور اعلام کردهاند که میزان بیان مناسبی از ژن پودی جیوسین توسط روش کلونیگ ژن آن در باکتریهای مناسب میزبان، قابل دستیابی است [3]. در مطالعه انجامشده توسط ژو و همکاران با استفاده از روشهای مولکولی و با ارزیابی 16SrDNA و 23SrDNA سویههای مختلف باکتری سراشیا مارسنس به لحاظ خویشاوندی ارزیابی شد [14]. این مطالعه به لحاظ آنکه در جستوجوی روابط خویشاوندی باکتری سراشیا مارسنس از طریق روشهای دقیق مولکولی ارزیابی ژنهای کدکنندهrRNA ها بوده است، با مطالعه حاضر انطباق دارد. در مطالعه انجامشده توسط هریس و همکاران خوشههای ژنی درگیر در تولید رنگدانه پرودی جیوسین، که تحت عنوان pig cluster نامیده شده بودند، از دو سویه متفاوت سراشیا کلون شده، تعیین توالی و نیز ارزیابی بیان شدند. در این مطالعه مانند مطالعه حاضر به بررسی و ارزیابی میزان بیان ژن پرودی جیسوسین پرداخته شده است و واریانتهای توالی مشاهدهشده در دو باکتری موردبررسی، جهت ارزیابی روابط تکاملی آنها و میزان خویشاوندی مورد استفاده قرار گرفته است [15]. در مطالعه انجامشده توسط خان و همکاران، پس از بررسی تمام ژنوم سراشیا مارسنس و ترسیم درخت فیلوژنیک، خویشاوندی نزدیک باکتری مذکور با باکتری سراشیا پالمیوتیکا به اثبات رسید. نتایج این مطالعه با نتایج ارزیابی خویشاوندی انجامشده در مطالعه حاضر انطباق دارد [16]. رنگدانههای پرودی جیوسین مواد شیمیایی آلی را جذب کرده و متخصصان داروساز نقش آن را در درمان بیماریهای عفونی مانند مالاریا به عنوان عوامل ایمنی یک دلیل عمده برای بررسی بیشتر کلونیهای باکتریایی سراشیا مارسنس میدانند. این بررسیها ویژگیها و قابلیتهای بالقوه پرودی جیوسین را برجسته خواهد کرد. همچنین نتایج بررسیهای فیلوژنتیکی انجامشده در مطالعه حاضر قادر است تعدادی از خویشاوندان نزدیک باکتری سراشیا مارسنس را به عنون کاندیدای مطالعات بعدی و نیز منبعی از رنگیزه مفید مورد بحث، معرفی کند. با انجام مطالعات بیشتر بر روی سایر سویههای تولیدکننده رنگیزه پرودی جیوسین و نیز به کار بردن میزبانهای کلونینگ پرتوانتر، میتوان تحقیق انجامشده در مطالعه حاضر را تکمیل کرد و نقاط ضعف آن را که ممکن است در انتخاب میزبان یا سویه تولیدکننده رنگیزه و یا روش کلونینگ به کار رفته باشد، جبران کرد. همچنین لازم است که در مطالعات آتی، پروتئین پرودی جیوسین تولیدشده به روش کلونینگ، مورد ارزیابی ساختاری و عملکردی قرار گیرد.
نتیجهگیری
پرودی جیوسین به دلیل ویژگیهای گزارششده از قبیل فعالیتهای ضدقارچی، سرکوبکنندههای ایمنی بدن و ضدپرولیفراسیون، یک داروی امیدوارکننده به نظر میرسد. همچنین مطالعات اخیر خواص ضدباکتریایی و ضدسرطانی این رنگدانه و اهمیت آن را در صنایع داروسازی نشان داده است و تولید گسترده آن به صورت تجاری، برای ساخت دارو مورد نیاز است. فرایند تولید این رنگدانه به صورت پیشسازهای منو و بیپیرول است که به صورت جداگانه سنتز شده و سپس به شکل نهایی پرودی جیوسین ترکیب میشوند. تولید رنگدانهها تنها در درصد کمی از ایزولههای میکروبی دیده میشود. سراشیا مارسنس از جمله منابع میکروبی تولیدکننده پرودی جیوسین شناخته شده است. بنابراین نیاز به تکثیر ژن این رنگدانه از منابع باکتریایی تولیدکننده آن، حائز اهمیت ویژه است. به همین دلیل در این پژوهش ژن pig از باکتری سراشیا مارسنس ایزوله شده از ادرار بیماران استخراج و با موفقیت به باکتری E.coli منتقل شد تا این آنزیم با توان بالاتر و صرفه اقتصادی بیشتر در E.coli به صورت نوترکیب تولید شود. بررسیهای بیشتر برای پیدا کردن سویههای جدید تولیدکننده پرودی جیوسین میتواند منجر به پیدا کردن منابع توانمندتر شود. ضمن آنکه یافتن باکتری سراشیا مارسنس در منابع مختلف و فراوان، میتواند ذخیرهای غنی برای کارخانجات تولیدکننده مواد مفید زیستی باشد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
اصول اخلاقی تماماً در این مقاله رعایت شده است.
حامی مالی
این تحقیق هیچ گونه کمک مالی از سازمانهای تأمین مالی در بخشهای عمومی ، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.
مشارکت نویسندگان
هر دو نویسنده در طراحی، اجرا و نگارش همه بخشهای پژوهش حاضر مشارکت داشتهاند.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
Refrence