بررسی بیان ژ نهای HOTAIR و HOXC13 در باف تهای توموری و نرمال حاشیه تومور در بیماران مبتلا به سرطان مری

مقدمه
سرطان مری نهمین سرطان شایع در سراسر جهان و ششمین علت شایع مرگ‌ومیر ناشی از سرطان است که هر ساله حدود 300 هزار نفر را به کام مرگ می‌کشاند [1 ,2]. بیشتر بیماران در ایران از مناطق شمالی و شمال‌شرقی ایران بوده‌اند. در یک مطالعه توسط پژوهشکده سرطان ایران، 9 درصد از کل سرطان‌ها و 27 درصد از سرطان‌های دستگاه گوارش، سرطان مری بودند [3]. از نظر بافت‌شناسی، سرطان مری دو نوع دارد، سرطان سلول‌های سنگفرشی مری و آدنوکارسینومای مری که بیش از 90 درصد سرطان مری را تشکیل می‌دهند [4]. 
از نظر مولکولی، اسیدهای ریبونوکلئیک غیر کدکننده طولانی از مولکول‌هایی هستند که افزایش بیان آن‌ها با پیشرفت سرطان همراه است. بنابراین، بیان متفاوت این مولکول‌ها ممکن است در تشخیص، پیش‌آگهی و درمان سرطان کمک‌کننده باشد [5]. اسیدهای ریبونوکلئیک غیر کدکننده طولانی طولی بیش از 200 نوکلئوتید دارند و رونویسی از آن‌ها توسط آنزیم اسید ریبونوکلئیک پلیمراز 2 انجام می‌شود. این مولکول‌ها عملکرد خود را به واسطه میان‌کنش با دی‌اِن‌اِی، اسیدهای ریبونوکلئیک و پروتئین انجام می‌دهند. نقش اسیدهای ریبونوکلئیک غیر کدکننده طولانی به عنوان عوامل سرکوبگر تومور یا آنکوژن‌ها در بسیاری از سرطان‌های شایع به اثبات رسیده است [7 ،6].
ژنHOTAIR  یکی از اسیدهای ریبونوکلئیک غیر کدکننده طولانی است. این ژن بر روی بازوی بلند کروموزوم 12 (12q13.13) واقع شده و حاوی 7 اگزون است. این ژن طولی در حدود 2158 bp دارد [8]. HOTAIR تنظیم بیان ژن‌های هاکس انسانی را بر عهده دارد و دارای یک نقش اساسی در تنظیم اپی ژنتیکی سرطان است [6]. این ژن نقش خود را از طریق اتصال به مجموعه تغییردهنده کروماتین نظیر  PRC2 ،REST ،LSD1و COREST انجام می‌دهد [9]. بدین صورت که ژن HOTAIR از طریق انتهای 5 خود به PRC2 متصل شده و باعث متیلاسیون لیزین 27 از هیستون سوم می‌شود. از طرف دیگر، این ژن از طریق انتهای 3 خود به مجموعه REST ،LSD1 و COREST متصل شده و منجر به دمتیلاسیون لیزین 4 از هیستون سوم می‌شود. حاصل متیلاسیون و دمتیلاسیون لیزین‌های هیستون سوم، سبب غیر فعال شدن ژن‌های هدف HOTAIR می‌شود [8]. تأثیر ژن HOTAIR در متاستاز سرطان پستان، تومورهای استرومایی معده‌ای-روده‌ای، سرطان کبد و ریه ثابت شده است [10].
ژن‌های خانواده هاکس، کدکننده فاکتورهای رونویسی است. عملکرد حفاظتی ژن‌های هاکس در تنظیم طرح محوری طی تشکیل طرح اولیه بدن در تکامل موجودات زنده نقش مهمی ایفا می‌کند. پژوهش‌های انجام شده بیانگر نقش ژن‌های هاکس در آنکوژن‌زایی بسیاری از بدخیمی‌ها است و سلول‌های سرطانی بیان بالای ژن‌های هاکس را نشان می‌دهند [11].
یکی از اعضای خانواده ژن‌های هاکس، ژن HOXC13 است. HOXC13 یکی از چندین ژن HOXC است که بر روی بازوی بلند کرومزوم 12 و در نزدیکی ژن HOTAIR قرار گرفته است. ژن HOXC13 حاوی 2 اگزون بوده و طولی در حدود bp 7752 دارد. این ژن تنها در هسته سلول‌ها یافت می‌شود و عملکرد خود را از طریق اتصال به مجموعه پیش همانندساز در اینترفاز G1 انجام می‌دهد و پس از آغاز سنتز از این ناحیه جدا می‌شود. ویژگی‌های ژن‌هایHOXC13، نظیر آن دسته از فاکتورهای رونویسی است که به سرعت با مولکول بعد از خود جایگزین می‌شوند و از نظر پایداری و ساکن بودن نیز همانند هیستون‌ها و کوهسین‌ها عمل می‌کنند [11, 12 ,13]. نقش این ژن در سرطان‌هایی نظیر سرطان تیروئید، استئوسارکوما، سرطان پستان و سرطان تخمدان مشاهده شده است [14]. 
ﻧﻘﺶ ژن HOTAIR در شکل‌گیری و ﻣﺘﺎﺳﺘﺎز ﺳﺮﻃﺎنﻫﺎی گوناگونی از ﺟﻤﻠﻪ پستان، ﮐﺒﺪ، ﻣﻌﺪه و روده ﺑﺮرﺳﯽ و ثابت شده است. افزایش بیان ژن HOTAIR در ﺗﻮﻣﻮرﻫﺎی اﺳﺘﺮوﻣﺎﯾﯽ ﻣﻌﺪه‌ای-روده‌ای ﻣﺘﺎﺳﺘﺎزدﻫﻨﺪه، اثبات شده است [10]. همچنین تأثیر ژن HOXC13 در سرطان‌هایی مانند سرطان تیروئید، سرطان استئوسارکوما، سرطان پستان و سرطان تخمدان مشاهده شده است [14]. گزارشات بیانگر میزان بیان بالای این ژن در سلول‌ها و بافت‌های سرطانی در مقایسه با افراد نرمال است. با توجه به تحقیقاتی که در دانشگاه شهید چمران اهواز بر روی این ژن‌ها در تومورهای کلون و معده انجام شد، نشان‌دهنده ارتباط بیانی این ژن‌ها با پیشرفت سرطان بود. به دلیل نزدیکی فیزیولوژیکی بافت‌های معده و مری و مجاورت ژن‌های HOTAIR و HOXC13 که هر دو بر روی بازوی بلند کرومزوم 12 هستند و با توجه به رابطه بیان و عملکرد مشابه ژن‌هایی که در نزدیکی یکدیگر قرار گرفته‌اند و همچنین بر اساس بررسی‌های صورت‌گرفته در پایگاه‌های اطلاعاتی، تاکنون ارتباط بین بیان ژن‌های HOTAIR و HOXC13 در سرطان مری و بافت‌های نرمال حاشیه تومور بررسی نشده است. بنابراین، مطالعه حاضر با هدف بررسی بیان ژن HOTAIR و HOXC13 در بافت‌های توموری سرطان مری و بافت‌های نرمال حاشیه تومور انجام شد.
روش بررسی 
در این مطالعه، در مجموع 60 نمونه‌ بافتی شامل 30 نمونه بافت تومور سرطان مری و 30 نمونه‌ بافت غیر توموری (حاشیه تومور) به‌صورت جفت شده بدین صورت که از هر فرد یک جفت بافت گرفته شد (یک نمونه بافت توموری و یک نمونه بافت نرمال حاشیه تومور). این بافت‌ها از بانک بافت‌های توموری انیستیتو کانسر تهران خریداری شد. نمونه‌ها پس از دریافت رضایت کتبی آگاهانه از بیماران و بلافاصله پس از جراحی توسط پاتولوژیست موردتأیید قرار گرفت و در بانک ذخیره شدند. به‌صورت بافت‌های خریداری‌شده در فریزر80 درجه ‌سانتی‌گراد نگهداری شدند. فرمول محاسبه حجم نمونه‌ها، تصادفی ساده است. بدین صورت که همه نمونه‌گیری‌ها بدون جایگزینی انجام می‌شود. در این‌ روش‌ تمام‌ اعضای‌ جامعه‌ دارای‌ شانس‌ مساوی‌ یا حداقل‌ شانس‌ معینی‌ برای‌ قرار گرفتن‌ در نمونه‌ خواهند بود. در این نوع نمونه‌گیری شانس انتخاب هر نمونه n/N است. معیار ورود به آزمایش تأیید پاتولوژی تومور توسط پاتولوژیست و تازه بودن نمونه‌ها بود (بیماران تحت شیمی‌درمانی و پرتودرمانی قرار نگرفته بودند). معیار خروج از آزمایش، نمونه‌هایی بودند که تأیید پاتولوژیست را نداشتند و یا تحت درمان قرار گرفته بودند.

تمامی آزمایش‌ها از جمله استخراج اسید ریبونوکلئیک از بافت‌ها، سنتز دی‌ان‌ای مکمل و ریل تایم پی‌سی‌آر در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی دانشگاه شهید چمران اهواز انجام شد. این مطالعه از نوع تجربی است. مشخصات کلینیک و پاتولوژی بیماران در جدول شماره 1 نشان داده شده است.

برای استخراج اسید ریبونوکلئیک از نمونه‌ها،50 تا 100 میلی‌گرم نمونه بافت به کمک ازت هموژنیزه شد. یک میلی‌لیتر محلول ترایزول برای لیز شدن سلول‌ها اضافه شد و سپس تمامی محتویات به میکروتیوب 1/5 میلی‌لیتری انتقال یافت. محلول در دمای اتاق به مدت 5 الی10 دقیقه انکوبه شد. سپس200 میکرولیتر کلروفرم افزوده شد. مخلوط با سر و ته کردن شدید به مدت 15 ثانیه همگن شد. میکروتیوب در سرعت 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ شدن، مخلوط سه فاز ایجاد شد. اسید ریبونوکلئیک در فاز بالایی، دی‌ان‌ای و پروتئین در فاز میانی و پایینی قرار گرفتند. سپس برای جلوگیری از آلودگی با پروتئین و دی‌ان‌ای، تقریباً 90 درصد فاز بالایی به ‌آرامی به تیوب جدید منتقل شد. ایزوپروپانول به‌اندازه‌ حجم مایع انتقال‌یافته اضافه شد. پس از مخلوط شدن به مدت20 دقیقه در فریزر 20 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. نمونه در سرعت 12000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز رویی تخلیه‌ شد و 1 میلی‌لیتر اتانول 75 درصد تهیه‌شده با آب تیمار شده با دیس افزوده شد و مخلوط تا کنده شدن رسوب ته میکروتیوب ورتکس شد. نمونه در سرعت 7800 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 8 دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی با وارونه کردن تیوب روی دستمال‌کاغذی تخلیه‌ شد و خشک کردن نسبی رسوب در دمای اتاق به مدت چند دقیقه انجام شد (خشک شدن کامل رسوب حلالیت آن را کاهش می‌دهد). رسوب در آب تیمار شده با دی‌اتیل‌پیروکربنات حل شد و نمونه‌ها در دمای 55 درجه به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند. کلیه مراحل برای به حداقل رساندن فعالیت آنزیم ریبونوکلئاز زیر هود لامینار انجام شد. کلیه محلول‌ها روی یخ نگهداری و جابه‌جایی مواد روی یخ انجام شد.
کیفیت و کمیت اسید ریبونوکلئیک استخراج شده به ترتیب توسط الکتروفورز و دستگاه نانودراپ ترموفیشر مورد بررسی قرار گرفت. الکتروفورز برای جداسازی مولکول‌های زیستی از یکدیگر با وارد کردن آن‌ها در یک میدان الکتریکی انجام می‌شود. نمونه اسید ریبونوکلئیکی که از نظر شیمیایی دست نخورده باشد و از نظر زیستی کیفیت استاندارد داشته باشد، نشان‌دهنده الگوی باند ویژه‌ای روی ژل آگارز است. وجود باندهای اسید ریبونوکلئیک 18s و 28s بیانگر اسید ریبونوکلئیک سالم و تام بودن است. عدم اسمیر یا کم بودن میزان آن در ژل نشان‌دهنده نمونه‌هایی با کیفیت بالا است. نسبت باند 28-S تقریباً دو برابر باند 18-S است. عدم حضور باندهای ریبوزومی 18-S و 28-S در ژل آگارز بیانگر تجزیه نمونه اسید ریبونوکلئیک به وسیله آنزیم ریبونوکلئاز است. همچنین به وسیله این دستگاه و حجم 1 الی 2 میکرولیتر از نمونه در مدت‌زمان کمتر از 10 ثانیه، کلیه طول‌ موج‌های موجود در طیف مورد‌نظر با دقت 1 نانومتر اسکن شد. با بررسی نسبت 260/280 و 230/260 خلوص اسید ریبونوکلئیک محاسبه شد .
در این مطالعه برای تکثیر اسید ریبونوکلئیک از پرایمرهای الیگو dT و6mer  و از کیت شرکت کیاژن استفاده شد. بدین منظور، ابتدا اسیدهای ریبونوکلئیک استخراج شده با تست آنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز l تیمار شدند. سپس سنتز دی‌ان‌ای مکمل از روی اسید ریبونوکلئیک الگو انجام شد. مراحل و شرایط دمایی و زمانی آن به شرح ذیل است:
برای تیمار با دئوکسی ریبونوکلئاز 1، 1 میکروگرم اسید ریبونوکلئیک استخراج شده به همراه 0/5 میکرولیتر بافر دئوکسی ریبونوکلئاز  10X Iو 0/5 میکرولیتر نوترکیب دئوکسی ریبونوکلئاز 1 برای 5 دقیقه در دمای70C°  در دستگاه ترموسایکلر (ساخت آزمایشگاه بایو-راد) قرار گرفتند. سپس برای از بین بردن دئوکسی ریبونوکلئاز 1 احتمالی، مقدار 0/25 اسید اتیلن دی آمین تترا استیکو 0/5 مولار به میکروتیوب افزوده شد. سپس به مدت 2 دقیقه و در دمای 80C°، در دستگاه ترموسایکلر قرار گرفتند. در بخش سنتز دی‌ان‌ای مکمل پرایمj2رهای 6mer و dT به مخلوط میکروتیوب افزوده شد. سپس به مدت 5 دقیقه و در دمای 65C°  در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شدند. در انتها، آنزیم رونوشت‌بردار معکوس به همراه بافر آن برای آغاز رونوشت‌برداری معکوس و ساخت دی‌ان‌ای مکمل افزوده شد. این فرآیند به مدت30 دقیقه و در دمای37C°  درجه انجام شد. سپس برای صحت انجام واکنش و سالم بودن دی‌ان‌ای مکمل سنتز شده، نمونه‌ها به وسلیه یک ژن خانه‌دار مانند بتا اکتین به همراه واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بررسی شدند.
برای انجام هر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، میزان 0/5 میکرولیتر (شرکت کیاژن) مسترمیکس به همراه 0/5 میکرولیتر پرایمر رفت و 0/5 میکرولیتر پرایمر برگشت و 1 میکرولیتر دی‌ان‌ای مکمل (ng/μl 20)که با 3 میکرولیتر آب دیونیزه شده به حجم نهایی 10 میکرولیتر رسانیده شد و در برنامه دمایی و زمانی که به شرح ذیل آمده است در دستگاه ترموسایکر قرار گرفتند. ابتدا واسرشت اولیه به مدت 5 دقیقه در دمای95C° ، سپس 45 سیکل (واسرشت به مدت 30 ثانیه در دمای95C° ، اتصال به مدت 30 ثانیه در دمای60C°  و گسترش به مدت زمان 30 ثانیه در دمای 72C°) و گسترش نهایی به مدت 5 دقیقه در دمای 72C° انجام شد. محصولات حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای ژن‌های آکتین-بتا HOTAIR و HOXC13 بر روی ژل آگارز 1 درصد تفکیک شده و با دستگاه ژل داکیومنتیشن از ژل عکس‌برداری شد.
در این مطالعه پرایمرها با نرم‌افزاراُلیگو طراحی شدند. بررسی اختصاصی بودن عملکرد پرایمرها نیز با پرایمر بلاست و از پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی آمریکا صورت گرفت (جدول شماره 2).
 

برای بررسی کّمی بیان اسید ریبونوکلئیک بر روی دی‌ان‌ای مکمل سنتز شده، واکنش ریل تایم پی‌سی‌آر از نوع کّمیت سنجی نسبی توسط دستگاه LightCycler مدل 96 وساخت شرکت Roch به روش سایبرگرین و با استفاده از کیت شرکت (TAKARA) در حجم20 میکرولیتر انجام شد.
2 میکرولیتر دی‌ان‌ای مکمل (ng/μl 50) را به همراه 10 پیکومول پرایمر رفت، 10 پیکومول پرایمر برگشت، میزان 10 میکرولیتر SYBR premix Ex Taq II (2x) و 6 میکرولیتر آب استریل به چاهک افزوده شد و مطابق با برنامه دمایی و زمانی انجام شد (جدول شماره 3).

برای بررسی تغییرات بیان ژن‌ها و مقایسه بیان ژن‌ها در بافت توموری نسبت به بافت حاشیه تومور از قانون Livak و روش 2-ΔΔCt استفاده شد (فرمول شماره 1).

در این رابطه ΔCt نمونه حاصل اختلاف بین سیکل‌های آستانه ژن هدف و کنترل داخلی در نمونه مورد آزمایش است و ΔCt کنترل نیز حاصل اختلاف میان سیکل‌های آستانه ژن هدف و کنترل داخلی در نمونه کنترل است. 
آنالیز آماری داده‌ها به وسیله نسخه 13 نرم‌افزارSPSS  انجام شد و از آزمون آماری تی‌تست و آنووا در نرم‌افزار گراف پد پریسم 8  استفاده شد و سطح معنادار 05/P≤0 مورد قبول واقع شد.
یافته‌ها
برای بررسی کیفیت اسید ریبونوکلئیک استخراج شده، میزان 1 تا 2 میکرولیتر از آن را بر روی ژل آگارز  1درصد الکتروفورز شد و سه باند شارپ 28-s rRNA و 18-s rRNA ،5-S rRNA رویت شد که در آن شکستگی و اسمیر وجود نداشت و تأییدکننده صحت اسید ریبونوکلئیک استخراج شده بود. 
در بررسی با نانودراپ، خوانش برای نسبت جذب نوری 260/280 انجام شد که بین بازه 1/8 تا 2 بودند که بیانگر خلوص بالای اسید ریبونوکلئیک تخلیص یافته است و این اسید عاری از هر گونه آلودگی با پروتئین و سایر نمک‌های آلی بودند.
برای اطمینان از صحت انجام واکنش و سالم بودن دی‌ان‌ای مکمل سنتز شده، نمونه‌ها به همراه ژن بتا اکتین توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج هر ژن روی ژل آگارز1  درصد برده شد. اندازه قطعات تکثیرشده مطابق اندازه‌های موردانتظار در جدول طراحی پرایمر که به ترتیب bp 109/91 و 86 است، مشاهده شدند (تصویر شماره 1).

پس از فراهم کردن شرایط تکثیر قطعه موردنظر، بیان کّمی ژن‌های HOTAIR و HOXC13 با استفاده از واکنش Real-Time واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در 30 جفت نمونه بافت توموری مری و بافت حاشیه تومور بررسی شد و داده‌های حاصل برای تمام نمونه‌ها با استفاده از قانون لیواک و روش ΔΔCt-2 و نسبت به ژن کنترل داخلی بتا اکتین  نرمال‌سازی انجام شد. تکثیر ژن بتا اکتین، HOTAIR و HOXC13 طی مراحل مختلف انجام واکنش ریل تایم پی‌سی‌آر طی 45 سیکل صورت گرفت. (هر منحنی بیانگر تکثیر ژن در یک نمونه است) (تصاویر شماره 2، 3، 4).

منحنی ذوب محصولات ریل تایم پی‌سی‌آر بیانگر تکثیر اختصاصی پرایمرها برای هر ژن است که در این مطالعه منحنی ذوب هر ژن مورد بررسی قرار گرفت و عدم وجود پرایمر دایمر و آلودگی تأیید شد (تصاویر شماره 5، 6، 7).

همچنین به منظور اطمینان از عملکرد اختصاصی پرایمرهای طراحی شده، محصولات حاصل از ریل تایم پی‌سی‌آر برای هر یک از ژن بتا اکتین، HOTAIR و HOXC13 بر روی ژل آگارز 2 درصد بارگزاری شدند. بدین صورت که برای هر ژن یک نمونه توموری و یک نمونه حاشیه تومور گذاشته شد. برای هر یک از ژن‌ها تک باند اختصاصی مشاهده شد که بیانگر عملکرد اختصاصی پرایمرها و عدم حضور باند دایمری و غیر اختصاصی است (تصویر شماره 8).

برای مقایسه بیان ژن‌های مذکور در نمونه‌های توموری نسبت به نمونه‌های حاشیه تومور (گروه کنترل) از قانون لیواک و روش ΔΔCt-2 و برای آنالیز داده‌ها از آزمون آماری تی‌تست و آنووا با استفاده از نرم‌افزار گراف پد پرایسم 8 در سطح معناداری 95 درصد (05/P≤0) انجام شد که نتایج حاصل از این بررسی در سطور زیر مطرح می‌شود.
مقایسه میزان بیان نسبی ژن HOTAIR در نمونه‌های بافت توموری مری نسبت به حاشیه تومور نشان داد بیان نسبی این ژن در نمونه‌های توموری نسبت به حاشیه تومور افزایش بیان 1/95 برابری داشته که از لحاظ آماری معنادار می‌باشد (0/0219=P) (تصویر شماره 9) (جدول شماره 4).

مقایسه میزان بیان نسبی ژن HOXC13 در نمونه‌های بافت توموری مری نسبت به حاشیه تومور به عنوان گروه کنترل نشان داد بیان نسبی این ژن در نمونه‌های توموری نسبت به حاشیه تومور افزایش بیان 14/4 برابری دارد که از نظر آماری معنادار (0/014=P) است (تصویر شماره 10) (جدول شماره 4).

رابطه بیان ژن‌های HOTAIR و HOXC13 با ویژگی‌های کلینیکوپاتولوژیک نمونه‌های سرطان مری مورد بررسی قرار گرفت (جدول شماره 5).

در این مطالعه ضریب همبستگی بین تغییرات بیان ژن‌های HOTAIR و HOXC13 مورد ارزیابی قرار گرفتند و نسبت Fold change ژن HOTAIR با ژن HOXC13 مقایسه شد که ضریب همبستگی میان این دو ژن 0/152 بود (0/2=P) (جدول شماره 6).

بحث
سرطان مری از لحاظ مرگ‌ومیر ششمین سرطان رایج در جهان است. در ایران نیز به عنوان یکی از 5 سرطان کشنده شناخته می‌شود. بروز سرطان مری در میان مردان بیشتر از زنان است و در سنین بالا مرگ‌ومیر ناشی از آن بیشتر اتفاق می‌افتد [15 ،1]. پیشرفت‌هایی در زمینه درمان این سرطان حاصل شده است، اما پیش‌آگهی این سرطان کماکان ضعیف است و شانس بقای 5 ساله بیماران مبتلا به سرطان مری بسیار اندک است. یکی از علل اصلی بقای بسیار کم این بیماران، فقدان مولکول مناسب برای تشخیص زودهنگام این سرطان است. شناسایی چنین مولکول‌هایی علاوه بر پیش‌آگهی در درمان نیز سودمند خواهند بود [16].
علل تشکیل‌دهنده سرطان از جنبه‌های گوناگونی به‌ویژه از نظر ژنتیکی مورد بررسی‌های فراوانی قرار گرفته است که بخش مهمی از این عوامل مستعدکننده در ارتباط با اسیدهای ریبونوکلئیک غیرکدکننده است. وجود تعداد بسیاری از انواع اسیدهای ریبونوکلئیک غیرکدکننده بلند با طول بیش از 200 جفت باز در انسان به اثبات رسیده است که در بسیاری از پژوهش‌ها از نقش آن‌ها به عنوان یکی از عوامل مهم در تومورزایی، عوامل سرکوبگر تومور یا آنکوژن‌ها در تعداد زیادی از سرطان‌ها عنوان شده است [17]. اغلب اسیدهای ریبونوکلئیک غیر کدکننده طولانی به‌صورت محدود به بافت و مختص به یک سرطان بیان می‌شوند و می‌توان از آن‌ها به عنوان مارکرهای پیش‌آگهی مفید استفاده کرد [18]. یکی از ژن‌ها در مطالعه پیش‌رو HOTAIR است. HOTAIR جزء اسیدهای ریبونوکلئیک غیر کدکننده طولانی است و بر روی بازوی کروموزوم 12 (12q13.13) واقع شده است و تنظیم بیان ژن‌های هاکس انسانی را بر عهده دارد. افزون بر اینکه HOTAIR در تکامل و الگوگیری محور بدن نقش مهمی دارد، اما هنگامی که تنظیم آن بهم می‌خورد منجر به القا پیشرفت سرطان می‌شود [8]. 
بعضی از ژن‌های هاکس در سرطان‌های گوناگون به‌صورت غیر طبیعی و خلاف حالت‌های نرمال بافت دیده شده‌اند که نقش این ژن‌ها کدکردن فاکتورهای رونویسی است. پس به نظر می‌رسد یک شبکه تنظیمی بر روی ژن‌های هاکس قرار گرفته است که در سرطان‌ها مختل می‌شود و عدم تنظیم آن می‌تواند منجر به شکل‌گیری و پیشرفت سرطان شود [19]. ژن HOXC13 یکی از اعضای خانواده هاکس است که بر روی بازوی بلند کروموزوم 12 (12q13.13) و در نزدیک HOTAIR واقع شده است. HOXC13 برخلاف HOTAIR، کدکننده پروتئین است. این ژن شامل 2 اگزون است و کدکننده فاکتورهای حفظ شده رونویسی مؤثر در تکامل جنین است [20]. گزارشات بیانگر وجود پروتئین‌های HOXC13 در روند تکثیر و همانندسازی است و نمایان‌گر نقش مهم این پروتئین‌ها در سرطان و پیشرفت آن است. از آنجایی که HOXC13 نقش بسزایی در حیات سلولی بازی می‌کند، در فرایند چرخه سلولی نیز مشاهده شده است. کاهش میزان بیان ژن‌های HOXC13 باعث القای آپاپتوز و افزایش بیان آن در القای تومورزایی نقش مهمی دارند. پس استفاده از این ژن به عنوان یک مارکر می‌تواند در تشخیص یا پیشرفت سرطان سودمند باشد [21, 22].
نتایج حاصل از آنالیز ریل تایم پی‌سی‌آر در این مطالعه نشان داد میانگین بیان نسبی ژن HOTAIR در بافت‌های توموری مری نسبت به بافت‌های حاشیه تومور به‌طور معناداری 1/95 برابر افزایش بیان دارد که این افزایش بیان ژن HOTAIR در بافت توموری نسبت به حاشیه تومور به علت نقش آنکوژنی ژن HOTAIR است. علاوه بر این، در بررسی ارتباط بیان ژن HOTAIR با سن و جنس افراد مبتلا به سرطان مری، رابطه معناداری دیده نشد (جدول شماره 4). 
در پژوهشی، آقای یانگ و همکاران‌اش عنوان کردند میزان بالای بیان HOTAIR می‌تواند به عنوان یک نشانگر زیستی برای پیشگیری از عود تومور در بیماران مبتلا به کارسینومای هپاتوسلولار کمک کند [23].
در پژوهشی که توسط هانگ بر روی بافت‌های توموری و حاشیه تومور در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال انجام شد، نشان دادند بیان ژن HOTAIR به طرز چشمگیری در نمونه‌های توموری نسبت به نمونه‌های حاشیه تومور دارای فرا تنظیمی است که این افزایش بیان ژن HOTAIR در بافت توموری نسبت به حاشیه تومور به علت نقش آنکوژنی ژن HOTAIR است [24].
لو و همکاران‌اش طی تحقیقاتی که بر روی نقش HOTAIR بر پیشرفت سرطان کولورکتال انجام دادند گزارش کردند HOTAIR در سرطان کولورکتال دارای بیان بالایی است و همچنین ناک‌داون کردن ژن HOTAIR باعث کاهش پیشرفت سرطان می‌شود [25].
اِندو و همکاران‌اش با تحقیق بر روی بیان HOTAIR در نمونه‌های سرطان معده، گزارش کردند که افزایش بیان این ژن در پیشرفت سرطان نقش دارد که این افزایش بیان ژن به علت نقش آنکوژنی ژن HOTAIR است. پس از بررسی ویژگی‌های کلینیکوپاتولوژی در تهاجم به گره لنفاوی، ارتباط معنادار مشاهده شد [26]. 
ژن حاضر دیگر در این مطالعه HOXC13 بود که بر اساس نزدیکی این ژن با HOTAIR و با توجه به نقش آن در شکل‌گیری سرطان انتخاب شد. در بررسی کّمی بیان ژن HOXC13، نتیجه این مطالعه نشان داد میانگین بیان نسبی ژن HOXC13 در بافت‌های توموری نسبت به بافت‌های حاشیه تومور افزایش بیان معنادار 14/4 برابری دارد که این افزایش بیان به علت نقش آنکوژنی ژن HOXC13 است. این نتیجه افزایش بیان در بافت تومور مری نسبت به بافت‌های حاشیه تومور با مطالعات دیگر که روی این ژن در سرطان‌های مختلف انجام شده است، همانند ملانوم [27] و کولون [28] مطابقت دارد. همچنین در بررسی ارتباط بیان ژن HOXC13 همانند ژن HOTAIR با سن و جنس افراد مبتلا به سرطان مری رابطه معناداری نشان نداد، اما میان میزان بیان ژن HOXC13 و متاستاز به نواحی دور، نوع و درجه تومور ارتباط معنادار وجود دارد (جدول شماره 4).
گالتا و همکاران‌اش در سرطان لیپوسارکوم نیز مطالعاتی بر روی بافت 57 بیمار در ارتباط با تأثیر بیان ژن HOXC13 بر شکل‌گیری سرطان و بدخیمی انجام دادند و گزارش کردند رابطه‌ای بین افزایش بیان این ژن و بدخیمی در لیپوسارکوم وجود دارد که این افزایش بیان به علت نقش آنکوژنی ژن HOXC13 است، اما رابطه معناداری میان سن و جنسیت با بیان ژن HOXC13 وجود ندارد [29].
در مطالعه‌ای دیگر که به‌ وسیله ژانگ و همکاران‌اش بر روی ژن HOXC13 و 47 نمونه مخاط دهان افراد مبتلا به سرطان آملوبلاستوم انجام شد، مشخص کردند این ژن در سرطان آملوبلاستوم به شدت بیان می‌شود [30]. همچنین در این مطالعه، رابطه همبستگی بین بیان نسبی ژن‌های HOTAIR و HOXC13 بررسی شد که میان این دو ژن همراهی مثبت مشاهده شد، اما معنادار نبود.
نتیجه‌گیری
مطالعه دقیق عوامل تنظیمی و درک صحیح مسیرهای مولکولی آن‌ها در شکل‌گیری تومور اولیه و گسترش آن، یکی از اهداف مهم برای پیشگیری و درمان سرطان است. در این مطالعه باید به این نکته توجه داشت که مطالعه حاضر به علت تعداد کم نمونه‌ها، تنها یک بررسی آزمایشی بوده که برای رسیدن به نتایج قابل اطمینان، نیاز به پژوهش‌های بیشتر در این زمینه و همچنین جامعه آماری وسیع‌تر است. استراتژی این مطالعه به‌ویژه در رابطه با اسیدهای ریبونوکلئیک غیر کدکننده طولانی در بررسی تومورها، دستیابی به یک مارکر بیولوژیک است که پس از تأییدات مکرر آن‌ها، این مارکرها می‌توانند در ادرار، خون یا در بافت فرد مورد شناسایی قرار گیرند. این پژوهش مقدمه‌ای بر تحقق این کار است. بنابراین، مطالعه حاضر تا حدی می‌تواند بیان‌کننده نقش این دو ژن در فرآیند تومورزایی در گسترش سرطان مری باشد. پس به علت ارتباط دو ژن HOTAIR و HOXC13 با سرطان و انجام مطالعات بیشتر در این زمینه، از این دو ژن می‌توان به عنوان اهداف راهبردی مناسب برای ایجاد استراتژی‌های تشخیصی و درمانی برای سرطان مری استفاده کرد.

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کد اخلاق این پژوهش  IR.IAU.PS.REC.1398.285است. تمامی نمونه‌ها مورد تأیید پاتولوژیست بوده‌اند و از آن‌ها رضایت کتبی آگاهانه دریافت شد.

حامی مالی
این مقاله برگرفته از پایان‌نامه«بررسی بیان ژن‌های HOTAIR و HOXC13 در بافت‌های توموری و نرمال حاشیه تومور در بیماران مبتلا به سرطان مری» در مقطع کارشناسی ارشد (سال 1398‌) با شماره پایان‌نامه 972028 در دانشگاه علوم‌پزشکی آزاد اسلامی تهران است و هیچ گونه کمک مالی از سازمان‌های تأمین مالی در بخش‌های عمومی، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.

مشارکت نویسندگان
مفهوم‌سازی: حمید گله‌داری؛ تحقیق و بررسی: محمد آریانپور و فلورا فروزش؛ ویراستاری و نهایی‌سازی: محمد آریانپور، حمید گله‌داری، فلورا فروزش. 

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.

References

1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018; 86(6):394-424. [DOI:10.3322/caac.21492] [PMID]
2. Chai J, Jamal MM. Esophageal malignancy: A growing concern. World J Gastroenterol. 2012; 18(45):6521-6. [DOI:10.3748/wjg.v18.i45.6521] [PMID] [PMCID]
3. Ghavamzadeh A, Moussavi A, Jahani M, Rastegarpanah M, Iravani M. Esophageal cancer in Iran. Semin Oncol. 2001; 28(2):153-7. [DOI:10.1016/S0093-7754(01)90086-7] [PMID]
4. Daly JM, Fry WA, Little AG, Winchester DP, McKee RF, Stewart AK, et al. Esophageal cancer: Results of an American College of Surgeons patient care evaluation study. J Am Coll Surg. 2000; 190(5):562-72. [DOI:10.1016/S1072-7515(00)00238-6]
5. Tang H, Wu Z, Zhang J, Su B. Salivary lncRNA as a potential marker for oral squamous cell carcinoma diagnosis. Mol Med Rep. 2013; 7(3):761-6. [DOI:10.3892/mmr.2012.1254] [PMID]
6. Noori-Daloii MR, Eshaghkhani Y. [lncRNAs: Significance and function mechanisms (Persian)]. Med Sci J Islam Azad Univ. 2015; 25(2):79-94. https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/20153355315
7. Slavoff SA, Mitchell AJ, Schwaid AG, Cabili MN, Ma J, Levin JZ, et al. Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells. Nat Chem Biol. 2013; 9(1):59- [DOI:10.1038/nchembio.1120] [PMID] [PMCID]
8. Huang X, Lu S. MicroR-545 mediates colorectal cancer cells proliferation through up-regulating epidermal growth factor receptor expression in HOTAIR long non-coding RNA dependent. Mol Cell Biochem. 2017; 431(1-2):45-54. [DOI:10.1007/s11010-017-2974-4] [PMID]
9. Tsai MC, Manor O, Wan Y, Mosammaparast N, Wang JK, Lan F, et al. Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science. 2010; 329(5992):689-93. [DOI:10.1126/science.1192002] [PMID] [PMCID]
10. Gupta RA, Shah N, Wang KC, Kim J, Horlings HM, Wong DJ, et al. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis. Nature. 2010; 464(7291):1071-6. [DOI:10.1038/nature08975] [PMID] [PMCID]
11. Marchetti L, Comelli L, D’Innocenzo B, Puzzi L, Luin S, Arosio D, et al. Homeotic proteins participate in the function of human-DNA replication origins. Nucleic Acids Res. 2010; 38(22):8105-19. [DOI:10.1093/nar/gkq688] [PMID] [PMCID]
12. Lemons D, McGinnis W. Genomic evolution of Hox gene clusters. Science. 2006; 313(5795):1918-22. [DOI:10.1126/science.1132040] [PMID]
13. Jave-Suarez LF, Schweizer J. The HOXC13-controlled expression of early hair keratin genes in the human hair follicle does not involve TALE proteins MEIS and PREP as cofactors. Arch Dermatol Res. 2006; 297(8):372-6. [DOI:10.1007/s00403-005-0623-3] [PMID]
14. Yamashita T, Tazawa S, Yawei Z, Katayama H, Kato Y, Nishiwaki K, et al. Suppression of invasive characteristics by antisense introduction of overexpressed HOX genes in ovarian cancer cells. Int J Oncol. 2006; 28(4):931-8. [PMID]
15. Kamangar F, Dores GM, Anderson WF. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: Defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 2006; 24(14):2137-50. [DOI:10.1200/JCO.2005.05.2308] [PMID]
16. Wang YL, Bai Y, Yao WJ, Guo L, Wang ZM. Expression of long non-coding RNA ZEB1-AS1 in esophageal squamous cell carcinoma and its correlation with tumor progression and patient survival. Int J Clin Exp Pathol. 2015; 8(9):11871-6. [PMCID]
17. Zhuang Y, Wang X, Nguyen HT, Zhuo Y, Cui X, Fewell C, et al. Induction of long intergenic non-coding RNA HOTAIR in lung cancer cells by type I collagen. J Hematol Oncol. 2013; 6:35. [DOI:10.1186/1756-8722-6-35] [PMID] [PMCID]
18. Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: The ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 2003; 3(6):453-8. [DOI:10.1038/nrc1098] [PMID]
19. Ma XJ, Wang Z, Ryan PD, Isakoff SJ, Barmettler A, Fuller A, et al. A two-gene expression ratio predicts clinical outcome in breast cancer patients treated with tamoxifen. Cancer cell. 2004; 5(6):607-16. [DOI:10.1016/j.ccr.2004.05.015] [PMID]
20. Taylor HS. Endocrine disruptors affect developmental programming of HOX gene expression. Fertil Steril. 2008; 89(S 2):e57-8. [DOI:10.1016/j.fertnstert.2007.12.030] [PMID] [PMCID]
21. Falaschi A, Abdurashidova G, Biamonti G. DNA replication, development and cancer: A homeotic connection? Crit Rev Biochem Mol Biol. 2010; 45(1):14-22. [DOI:10.3109/10409230903365608] [PMID]
22. Del Bene F, Wittbrodt J. Cell cycle control by homeobox genes in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 2005; 16(3):449-60. [DOI:10.1016/j.semcdb.2005.02.001] [PMID]
23. Yang Z, Zhou L, Wu LM, Lai MC, Xie HY, Zhang F, et al. Overexpression of long non-coding RNA HOTAIR predicts tumor recurrence in hepatocellular carcinoma patients following liver transplantation. Ann Surg Oncol. 2011; 18(5):1243-50. [DOI:10.1245/s10434-011-1581-y] [PMID]
24. Yang XD, Xu HT, Xu XH, Ru G, Liu W, Zhu JJ, et al. Knockdown of long non-coding RNA HOTAIR inhibits proliferation and invasiveness and improves radiosensitivity in colorectal cancer. Oncol Rep. 2015; 35(1):479-87. [DOI:10.3892/or.2015.4397] [PMID]
25. Lu X, Liu Z, Ning X, Huang L, Jiang B. The long noncoding RNA HOTAIR promotes colorectal cancer progression by sponging miR-197. Oncol Res. 2018; 26(3):473-81. [DOI:10.3727/096504017X15105708598531] [PMID] [PMCID]
26. Endo H, Shiroki T, Nakagawa T, Yokoyama M, Tamai K, Yamanami H, et al. Enhanced expression of long non-coding RNA HOTAIR is associated with the development of gastric cancer. PloS One. 2013; 8(10):e77070. [DOI:10.1371/journal.pone.0077070] [PMID] [PMCID]
27. Cantile M, Scognamiglio G, Anniciello A, Farina M, Gentilcore G, Santonastaso C, et al. Increased HOX C13 expression in metastatic melanoma progression. J Transl Med. 2012; 10:91. [DOI:10.1186/1479-5876-10-91] [PMID] [PMCID]
28. Kasiri S, Ansari KI, Hussain I, Bhan A, Mandal SS. Antisense oligonucleotide mediated knockdown of HOXC13 affects cell growth and induces apoptosis in tumor cells and over expression of HOXC13 induces 3D-colony formation. RSC Adv. 2013; 3(10):3260-9. [DOI:10.1039/c2ra22006g] [PMID] [PMCID]
29. Cantile M, Galletta F, Franco R, Aquino G, Scognamiglio G, Marra L, et al. Hyperexpression of HOXC13, located in the 12q13 chromosomal region, in welldifferentiated and dedifferentiated human liposarcomas. Oncol Rep. 2013; 30(6):2579-86. [DOI:10.3892/or.2013.2760] [PMID] [PMCID]
30. Zhong M, Wang J, Gong Y, Li J, Zhang B, Hou L. [Expression of HOXC13 in ameloblastoma (Chinese)]. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2007; 42(1):43-6. [PMID]