Document Type : Original Article
Authors
1 Department of Cell and Molecular Biology, School of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran
2 Department of Medical Laboratory Sciences, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
Introduction
Cancer is defined as a group of diseases characterized by uncontrolled abnormal cell growth and their spread to other parts of the body. Breast cancer is the most prevalent cancer in women and is ranked second in terms of female mortality. Mutations in genes such as BRCA1, BRCA2, and p53 are commonly observed in breast cancer. Apoptosis, a process vital for cellular growth and eliminating abnormal cells, plays a significant role in cancer. One of the important proteins in the apoptotic pathway is the DNA fragmentation factor-45 (DFF45) which has a role in inhibiting DFF40. Studies have shown increased expression of DFF45 in various cancers. Microautophagy, macroautophagy, and chaperone-mediated autophagy are involved in removing harmful substances from cells. Defects in the autophagy pathways can lead to harmful substance accumulation.
Quercetin, a natural antioxidant found in plants, has demonstrated anticancer properties against breast, colon, ovarian, endometrial, and lung cancers. The mechanisms of action of this pigment include regulation of p53 protein, cell cycle arrest, inhibition of tyrosine kinases, prevention of heat shock protein production, and induction of apoptosis. On the other hand, SiRNA, a gene-silencing sequence, has received attention in cancer treatment. It can suppress the expression of key components involved in cancer progression. Combining siRNA with other treatments enhances therapeutic efficacy while reducing adverse effects. This study aims to sensitize breast cancer cells to apoptosis for facilitating the cytotoxic effects of quercetin at lower concentrations and, thus, minimizing potential side effects.
Material and Methods
Human MCF-7 cells were obtained from the Iranian Biological Resource Center and cultured in RPMI-1640 medium supplemented with L-glutamine, sodium pyruvate, 10% fetal bovine serum, and 1% penicillin/streptomycin antibiotics. Six different concentrations of the quercetin were prepared and evaluated. Quercetin, with a molecular weight of 302.24 g/mol, was dissolved to create a drug solution with a concentration of 0.0330862×106 µM. The MTT assay was used to measure cell proliferation after exposure to various substances and the toxicity of these substances. This assay is based on reducing a yellow tetrazolium salt to an insoluble formazan crystal by the mitochondrial succinate dehydrogenase. The resulting solution’s optical absorption was measured at 570 nm using an ELISA reader.
The cells were cultured in a 6-well plate without antibiotics. After 24 hours, a prepared solution of siRNA-DFF45 was added using lipofectamine. The cells were then incubated, subjected to quercetin after 24 hours. Total cellular RNA was extracted 48 hours later. RNA extraction from the cells was performed using the RNX-plus solution kit. The extracted RNA was isolated and washed with cold isopropyl alcohol, and its absorption was measured. Random hexamer primers and reverse transcriptase enzymes were used for cDNA synthesis. Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Real-time RT-PCR) was conducted using the SYBR Ex Taq kit and the Applied Biosystems Real-time PCR system to analyze the expression levels of target genes involved in apoptosis, autophagy, and cell survival. Gapdh was used as a reference gene for normalization. The data of real-time RT-PCR were analyzed using the ABI Step One software.
Results
In the MTT assay, cells were treated with different concentrations of quercetin for 48 and 72 hours, and the concentration that reduced the cell viability by 50%, which is called Lethal Concentration 50 (LC50), was determined. The results showed an LC50 value of 220 μM for the 48-hour treatment (Figure 1).
The cells were treated with siRNA, quercetin, and siRNA+quercetin. The findings revealed that siRNA treatment caused a 30% decrease in cell viability; quercetin treatment led to a 55% reduction, and the combined treatment resulted in a 65% decrease (Figure 2).
This indicates the higher cytotoxic effect of quercetin on cells when DFF45 expression was reduced. Statistical analyses revealed significant differences between siRNA treatment and the combined treatment (siRNA+quercetin) (P<0.01) and between quercetin treatment and siRNA, (P<0.05).
The real-time RT-PCR results demonstrated that siRNA treatment caused more than 80% decrease in DFF45 expression. Quercetin treatment resulted in a 50% decrease in DFF45 expression, while the combined treatment did not considerably affect DFF45 expression.
The analysis of the expression of genes in the apoptosis pathway revealed that siRNA treatment decreased the expression of p53, BAX, BCL-2, and caspase-3 genes, but no significant change in the expression of AIF gene (Figure 3).
In the autophagy pathway, siRNA treatment reduced the expression of ATG5, damage-regulated autophagy modulator (DRAM), and Beclin genes, while LC3 gene expression remained unchanged (no significant effect). Quercetin treatment increased the expression of LC3 and Beclin genes, but had no significant effect on ATG5 and DRAM genes. The combined treatment increased LC3 expression and further reduced the expression of ATG5 and DRAM genes (Figure 4).
The results indicate that the activation of autophagy pathway leads to a 55% and 65% decrease in cell viability under quercetin and combined treatment (siRNA+quercetin), respectively. Both siRNA and quercetin treatments generally affected the expression of genes in the AKT/mTOR pathway (Figure 5).
Conclusion
In this study, siRNA-DFF45 was used to downregulate the expression of the DFF45 gene simultaneously with the administration of quercetin to induce cell death in MCF-7 cancer cells. Although most anticancer drugs induce apoptosis leading to the elimination of cancer cells, the cell death induced by these drugs is not always done through the apoptotic pathway, which was confirmed in this study. One of the main characteristics of cancer is resistance to apoptosis due to mutations in pro-apoptotic and anti-apoptotic genes and alterations in their expression. In addition, many cancer therapies demonstrate their cytotoxic effects by activating the apoptosis pathway, making the intervention in this pathway a potential strategy for cancer treatment. The results of this study showed that the treatment of MCF-7 cancer cells with quercetin, along with downregulation of DFF45 gene using siRNA-DFF45 induced cell death.
Based on these findings, it can be concluded that the simultaneous use of siRNA-DFF45 with quercetin enhances the cytotoxic effect of quercetin by 10%. Quercetin, as a natural antioxidant found in various plants, can play a significant role in breast cancer prevention.
Ethical Considerations
Compliance with ethical guidelines
There were no experiments on human or animal samples. Therefore, no ethical considerations were needed.
Funding
This research did not receive any specific grant from funding agencies in the public, commercial, or not-for-profit sectors.
Authors contributions
Conceptualization, methodology, software: Seyed Jalal Zargar and Shahrokh Safarian; Supervision and data curation: Seyed Jalal Zargar; Writing, initial draft preparation, and investigation: Toktam Sadat Koleini; Writing, review & editing: Mostafa Saberian; Final approval: All authors.
Conflicts of interest
The authors declared no conflict of interest.
مقدمه
سرطان، گروهی از بیماریها را شامل میشود که مشخصه آنها تقسیم و تکثیر سلولی تنظیمنشده است. از ویژگیهای سرطان، تهاجم و انتشار سلولها از جایگاه اصلی به نقاط دیگر بدن است [1]. سرطان پستان بهعنوان شایعترین سرطان در زنان و دومین عامل مرگ در زنان پس از سرطان ریه شناخته شده است [2]. جهش در ژنهای BRCA1 و BRCA2 در حدود 80 تا 90 درصد سرطان پستان ارثی و جهش در ژن p53 در 50 درصد سرطانها مشاهده شده است [3]. یکی از فرایندهای مهم در رشد و تمایز سلولی، التهاب، نگهداری و هوموستازی بافتها و پاکسازی سلولهای غیرطبیعی و زائد، آپوپتوز است [4, 5, 6]. یکی از پروتئینهای اصلی در مسیر آپوپتوز DFF45 است که نقش اصلی آن مهار DFF40 است [7, 8]. مطالعات نشان داده است بیان DFF45 و DFF35 در برخی سرطانها از جمله کلون، اندومتریال، تخمدان و گلیوبلاستوما افزایش مییابد [9, 10, 11].
در مطالعهای که ژانگ و همکاران انجام دادند، مشخص شد یکی از اهداف mir-145 ،mRNA مربوط به DFF45 است و miR-145 در سلولهای سرطانی کلون نسبت به سلولهای نرمال کاهش یافته است [12]. بنابراین کاهش بیان DFF45 میتواند در درمان سرطان مفید واقع شود. علاوهبراین اتوفاژی که یک فعالیت خودتخریبی است نقش مهمی در از بین بردن پروتئینهایی با تاخوردگی نابجا و تجمعیافته و حذف ارگانلهای آسیبدیده و همچنین حذف پاتوژنهای درونسلولی دارد. اتوفاژی بهعنوان یک مکانیسم بقای سلولی در نظر گرفته میشود که به 2 صورت انتخابی و غیرانتخابی انجام میشود [13]. در تخریب پروتئولیتیک اجزای سیتوزول 3 نوع اتوفاژی میکرو، ماکرو و CMA دخالت دارند [13].
نقص در هریک از مسیرهای تخریبی منجر به تجمع مواد مضر در سلول و افزایش تجمعات سلولی میشود. ازاینرو استفاده از مواد ضدسرطانی بهعنوان یک روش درمانی برای مقابله با تکثیر نابجای سلولی ضروری است. یکی از این قبیل مواد کوئرستین است. کوئرستین یک آنتیاکسیدان طبیعی است که در گیاهان مختلف یافت میشود و خواص ضدسرطانی آن در شرایط آزمایشگاهی و در شرایط طبیعی ثابت شده است. کوئرستین نقش مهمی در جلوگیری از سرطانهای پستان، کولون، تخمدان، اندومتریوم و ریه دارد. کوئرستین بهدلیل مهار رادیکالهای آزاد و اتصال به یونهای فلزی، بهعنوان یک آنتیاکسیدان قوی شناخته میشود [14]. آسیبهای اکسیداتیو به DNA بهعنوان یک عامل خطر برای سرطان شناخته شده است [15].
آنتیاکسیدانهایی مانند کوئرستین نقش مهمی در محافظت سلول در برابر آسیبهای وارده بهوسیله گونههای فعال اکسیژن و گونههای فعال نیتروژن بازی میکنند [16]. از مکانیسمهای مولکولی عمل کوئرستین میتوان به افزایش پروتئین p53 و توقف چرخه سلولی، تنظیم کاهشی پروتئین p53 جهشیافته، مهار تیروزین کینازها، ممانعت از تولید پروتئینهای شوک حرارتی، ممانعت از بیان پروتئینهای Ras، قابلیت اتصال به گیرندههای استروژن و القای آپوپتوز اشاره کرد [17].
از طرفی امروزه استفاده از siRNA بهعنوان توالی خاموشکننده بیان ژنها رشد قابلتوجهی داشته است. توالیهای siRNA داپلکس 2 رشتهای RNA به طول 21 تا 23 نوکلئوتید است که 2 تا 3 نوکلئوتید آویخته متقارن در انتهای OH ʹ3 و P ʹ5 دارد [18]. در تحقیقات گذشته برای درمان سرطان از تزریق مستقیم siRNA در مدلهای حیوانی استفاده شده است و نقش آنها در جلوگیری از پیشرفت تومورها اثبات شده است [19]. بهعلاوه siRNA میتواند بیان گیرندههای تیروزین کیناز، ژنهای ضدآپوپتوزی، ژنهای بقای سلولی، عوامل رشد پیشبرنده تومور یا ژنهای مسئول در تکثیر سلول مانند سیکلینها را مهار کند. همراهی siRNA با روشهای درمانی دیگر ازجمله داروها میتواند با تشدید عملکرد دارویی تا حد زیادی از اثرات جانبی ناشی از مصرف داروها در دُز بالا جلوگیری کند [20]. این روش میتواند بهعنوان یک استراتژی پیشگیرانه و درمانی جدید برای مدیریت سرطان به کار رود. هدف از این مطالعه حساستر کردن سلولهای سرطانی پستان نسبت به آپوپتوز بهمنظور فراهم آوردن شرایطی برای ظاهر شدن اثرات کشندگی کوئرستین، بهعنوان داروی انتخابی در درمان سرطان پستان، در غلظتهای کمتر است تا از این طریق اثرات جانبی این دارو تا حد امکان کاسته شود.
روش بررسی
کشت سلول
رده سلولیMCF-7 از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شد. سلولها در محیط کشتRPMI-1640 ( (Gibco-1597562 حاوی L-glutamine و فاقد بیکربنات سدیم با 10 درصد سرم جنین گاوی (انستیتو پاستور ایران FB-500) همراه با 1 درصد آنتیبیوتیک پنیسیلین/استرپتومایسین کشت داده شدند. جمعیت سلولهایMCF-7 معمولاً هر 24 تا 32 ساعت 2 برابر میشود [21].
آمادهسازی داروی کوئرستین و تیمار سلولی:
برای محاسبه و تعیین غلظت مؤثر داروی کوئرستین جهت کاهش 50 درصدی بقای سلولها (LC50)، 6 غلظت از این دارو شامل 50، 100، 250، 400، 600 و 800 میکرومولار انتخاب شدند. کوئرستین با وزن مولکولی 302/24 گرم/مول تهیه شد [22]. محلول دارویی با غلظت 106×0/0330862 میکرومولار تهیه شد. برای تهیه 6 غلظت ذکرشده، حجم موردنیاز از محلول دارویی با استفاده از فرمول شماره 1 محاسبه شد:
که به هر چاهک از پلیت 96 خانه میکرولیتر 130 محلول دارویی سترون شده با فیلتر 0/22 میکرومتر و محیط کشت اضافه شد [23].
آزمون رنگسنجی MTT
آزمون MTT برای اندازهگیری میزان تکثیر سلولها در مواجهه با عوامل مختلف و تعیین میزان سمیت این عوامل هنگامیکه بر روی سلولها اثر داده میشوند، کاربرد دارد. اساس این روش بر پایه توانایی آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی در سلولهای زنده بهمنظور احیا و تبدیل حلقههای نمک زرد رنگ تترازولیوم (MTT) به بلورهای نامحلول در آب و بنفشرنگ فورمازان است که قادر به عبور از غشا نیستند. به همین علت بلورهای فورمازان را با استفاده از حلالهای آلی به فرم محلول درمیآورند و از سلولها بیرون میکشند. در این آزمون معمولاً دی متیل سولفوکساید و گاهی سدیم دودسیل سولفات در اسید هیدروکلریک رقیق بهعنوان حلال مورد استفاده قرار میگیرند.
جذب نوری محلول حاصل را میتوان با استفاده از دستگاه الایزا ریدر در طول موج 570 نانومتر با طول موج مبنای 630 نانومتر اندازهگیری کرد. باتوجهبه اینکه واکنش احیای MTT تنها در سلولهای زنده رخ میدهد که دارای آنزیم دهیدروژناز فعال هستند، مقدار عددی بهدستآمده توسط این روش بهطور مستقیم با تعداد سلولهای زنده در ارتباط است. در این سنجش میزان فورمازان تولیدشده توسط سلولهای تیمارشده با یک عامل خاص را با میزان فورمازان تولیدشده توسط سلولهای کنترل که تیمار خاصی دریافت نکردهاند، مقایسه میکنند. از این مقایسه، میزان اثر عامل تیماری خاص را به روی مرگ و مهار رشد سلولها تعیین میکنند. هرچه میزان جذب نوری خواندهشده نسبت به حالت کنترل کمتر باشد، میتوان نتیجه گرفت که تعداد سلولهای زنده کم و مهار رشد سلولی بیشتر صورت گرفته است [24].
آزمون MTT در زمان 48 ساعت پس از تیمار دارویی انجام شد. برای مراحل انجام این آزمون بهطور خلاصه ابتدا 104 سلول MCF-7 در پلیت 96 خانهای کاشته شدند. پس از رسیدن تراکم سلولها به 80 درصد، تیمار دارویی با کوئرستین در غلظتهای مشخص انجام شد. یک چاهک نیز بهعنوان کنترل درنظر گرفته شد. پس از 48 ساعت، محیط کشت تعویض شد. سپس محلول MTT به هر چاهک اضافه شد و پلیت 3 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد در شرایط استاندارد قرار داده شد. پس از طی شدن زمان انکوباسیون محیط کشت حاوی MTT از هر چاهک تخیله شد و به هریک از چاهکها DMSO اضافه شد تا باعث محلول شدن و خروج بلورهای فورمازان از سلولها شود. درنهایت پلیت در دستگاه الایزا ریدر در طول موج 570 نانومتر بر پایه رفرانس 630 نانومتر بررسی شد.
ترانسفکت کردن سلولها با siRNA-DFF45
105×5 سلول در پلیت 6 خانه با محیط کشت بدون آنتیبیوتیک کشت داده شدند. بعد از 24 ساعت محلول آمادهشده siRNA-DFF45 با لیپوفکتامین در دمای محیط، به سلولها اضافه شد. سپس سلولها در انکوباتور قرار داده شدند و پس از 24 ساعت تیمار دارویی با کوئرستین انجام شد و پس از گذشت 48 ساعت RNA تام سلولی استخراج شد [12].
استخراج RNA، سنتز cDNA
در این مطالعه استخراج RNA تام بهوسیله کیت RNX plus Solution for total RNA isolation ساخت شرکت سینا ژن انجام شد که مراحل آن بهطور خلاصه بیان میشود. ابتدا محلولRNX plus به سلولها اضافه شد و سوسپانسون یکنواخت شد. در مرحله بعد کلروفرم سرد اضافه شد. سپس سوسپانسیون به 15 دقیقه با سرعت 12000 دور بر دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. فاز رویی که حاوی RNA بود به ویال جدید منتقل شد. سپس معادل حجم محلول حاوی RNA، ایزوپروپیل الکل سرد اضافه شد و مجدداً سانتریفیوژ شد. فاز رویی تخلیه شد و رسوب با اتانل سرد شستوشو شد. پس از سانتریفیوژ، آب تیمارشده با دیاتیل پیروکربنات اضافه شد. RNA استخراجشده ابتدا در دمای 20-درجه سانتیگراد و سپس بعد از 24 ساعت در دمای 70-درجه سانتیگراد نگهداری شد [25].
بهمنظور ارزیابی کمی و کیفی RNA، جذب محلول با استفاده از نانودراپ (Thermo Scientific) در طول موجهای 260، 280 و 230 نانومتر اندازهگیری شد [26].
برای سنتز DNA مکمل (cDNA) از پرایمرهای رندوم هگزامر و آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ساخت شرکت Fermentase استفاده شد. آنزیم M-MuLV یک پروتئین منومر است که دارای فعالیت پلیمرازی وابسته به RNA و DNA و فعالیت RNAase H اختصاصی RNA، در هیبرید RNA-DNA است. این آنزیم قادر است بهطور کارا تا یک cDNA تکرشتهای به طول 13 کیلوبایت را سنتز کند. فعالیت بهینه آن در 37 درجه سانتیگراد که در انواع مهندسیشده تا 55 درجه سانتیگراد افزایش یافته است. پرایمرهای رندوم هگزامر، ساخت cDNA را از تمام طول RNA و همچنین از روی RNAهای انتقالی و ریبوزومی انجام میدهند [27].
بهطور خلاصه، سنتز cDNA به این ترتیب انجام شد: ابتدا معادل 1 میکروگرم از RNA استخراجشده به 1 میکرولیتر رندوم هگزامر اضافه شد و با آب دیاتیل پیروکربنات به حجم 13 میکرولیتر رسانده شد. انکوباسیون بهمدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد باعث باز شدن ساختارهای دوم RNA و تسهیل اتصال پرایمرها شد. مواد مورد نیاز جهت سنتز شامل 3/5 میکرولیتر از Reaction Buffer(5X)، محلول 5/0 میکرولیتر از محلولRiboLock RNase inhibitor ، 2 میکرولیتر از dNTP mix و 1 میکرو لیتر از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس RevertAidTM M-MuLVtase به محلول واکنش اضافه شد و با رسیدن حجم محلول به 20 میکرولیتر بهمدت 10 دقیقه در 25 درجه سانتیگراد (برای فعالسازی آنزیم) و سپس 60 دقیقه در 42 درجه سانتیگراد (برای سنتز cDNA) انکوبه شد. سپس با حرارت دادن نمونه در 70 درجه سانتیگراد بهمدت 10 دقیقه (برای غیرفعالسازی آنزیم RT) به واکنش خاتمه داده شد. محصول در ویالهای مختلف تقسیم و در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد.
بررسی میزان بیان ژنهای هدف
برای انجامReal Time RT-PCR از کیت SYBR premix Ex Taq TAKARA با شماره خرید RR420 و دستگاه Applied Biosystems Real time PCR استفاده شد. بعد از سنتز cDNA، بیان ژنهای مسیر آپوپتوز (caspase-3 ،aif ،bcl-2 ،p53 و bax)، مسیر اتوفاژی ( lc3 ،atg5 ،dramو beclin) و محور بقای سلولی (pten ، akt1 و mtor) همراه با بیان ژن dff45 در تیمارهای siRNA-DFF45، کوئرستین و تیمار همزمان (siRNA+کوئرستین) انجام شد. واکنش Real time RT-PCR با حداقل 2 تکرار برای هر ژن و با استفاده از ژن مرجع gapdh انجام شد و دادههایReal time RT-PCR با کمک نرمافزار ABI STEP ONE به روش CTΔΔ تحلیل شد. عدد نهایی CTΔΔ-2 حاصل از تکرارهای مختلف به کمک نرمافزار اکسل نسخه 2013 تجزیهوتحلیل آماری شد. برای بررسی معنادار بودن دادههای هر تیمار در مقایسه با کنترل از آزمون تی در سطح معناداری 0/05>P استفاده شد.
برای انجام آزمایش، ویالها در دستگاه قرار داده شد و با برنامه زیر رانده شد:
دناتوراسیون اولیه 15 ثانیه در 90 درجه سانتیگراد انجام شد و سپس 40 سیکل تکثیر به این شکل انجام شد: 5 ثانیه در 95 درجه سانتیگراد، 34 ثانیه در 60 درجه سانتیگراد و 30 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد.
در هر بار رانده شدن دستگاه، نمونه NTC که فاقد cDNA بود برای هر پرایمر در نظر گرفته شد تا از عملکرد صحیح واکنش زنجیره ای پلیمراز اطمینان حاصل شود.
یافتهها
بهطور خلاصه، اثرات ضدسرطانی داروی کوئرستین در تیمار همزمان کوئرستین و siRNA-DFF45 بر روی رده سلولی MCF-7 با تأکید بر مسیرهای بقای سلولی، آپوپتوز و اتوفاژی بررسی شد. برای تعیین بهترین غلظت و زمان تیمار دارویی، توان حیاتی سلولها با استفاده از آزمونMTT اندازهگیری شد. به این منظور سلولها در غلظتهای مختلف دارویی در 48 و 72 ساعت مورد بررسی قرار گرفتند و غلظت مؤثری از دارو که توان حیاتی سلولها را به میزان 50 درصد کاهش میداد (LC50)، تعیین شد. همچنین توان حیاتی سلولها در تیمارهای siRNA و دارو+siRNA با آزمون MTT اندازهگیری شد. سپس برای بررسی اینکه آیا DFF45 میتواند هدف مناسبی در درمان سرطان پستان باشد از siRNA-DFF45 برای کاهش بیان این ژن در رده سلولی MCF-7 استفاده شد. سلولها با استفاده از لیپوفکتامین 2000 ترانسفکت شدند و پس از تیمار با کوئرستین، کاهش بیان در سطح mRNA با Real time RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل به شرح ذیل است:
آزمون رنگسنجی MTT
در آزمون رنگسنجی MTT بهمنظور بررسی توان حیاتی سلولها و کاهش 50 درصدی آن، تیمار سلولها با کوئرستین با غلظتهای 50، 100، 250، 400، 600 و 800 میکرو مولار در 2 زمان 48 و 72 ساعت انجام شد و نتایج با استفاده از نرمافزار اکسل نسخه 2013 مورد تجزیهوتحلیل آماری قرار گرفت. نتایج حاصل از آزمون MTT در تصاویر شماره 1 و 2 قابلمشاهده است.
باتوجهبه نمودارهای مربوط به تیمارهای 48 و 72 ساعته، نمودار بقای سلولی در تیمار 48 ساعته برای تعیین LC50 مورد استفاده قرار گرفت (تصویر شماره 3).
باتوجهبه این منحنی میزان LC50، 220 میکرومولار به دست آمد که در این پژوهش در تمام مراحل کاری مورد استفاده قرار گرفت.
پس از به دست آوردن غلظت مؤثر دارو جهت کاهش 50 درصدی در توان حیاتی سلولها، سلولها تحت تیمارهای siRNA، کوئرستین و (siRNA+کوئرستین) قرار گرفتند. آزمون MTT جهت سنجش توان حیاتی سلولها انجام شد (تصویر شماره 4).
توان حیاتی در سلولهای تیمارشده با siRNA به میزان 30 درصد کاهش یافت و تیمار با کوئرستین سبب کاهش 55 درصدی توان حیاتی شد. همچنین تیمار همزمان (siRNA+کوئرستین) سبب کاهش 65 درصدی توان حیاتی سلولها شد که نشاندهنده افزایش اثر کشندگی کوئرستین در زمان کاهش بیان dff45 است.
نتایج بهدستآمده از روش Real time RT- PCR
نتایج حاصل ازReal time RT-PCR نشان داد تیمار با siRNA سبب کاهش بیش از 80 درصدی بیان dff45 و تیمار با کوئرستین نیز سبب کاهش بیان dff45 به میزان 50 درصد در سلولها شده است. در تیمار همزمان (siRNA+کوئرستین)، حضور کوئرستین اثر قابلتوجهی در کاهش سطح بیان dff45 در زمان تیمار با siRNA نداشته است (تصویر شماره 5).
میزان بیان ژنهای مسیر آپوپتوز در تیمارهای مختلف بهمنظور بررسی دخالت این مسیر در کاهش توان حیاتی سلولها در تیمارهای مختلف بررسی شد و نتایج آن در تصویر شماره 6 مشاهده میشود.
تیمار سلولها با siRNA سبب کاهش در سطح بیان ژنهایp53 ،bax ،bcl-2 وcaspase-3 نسبت به کنترل شد، اما تغییر معناداری در سطح بیان ژن aif ملاحظه نشد.
میزان بیان ژنهای مسیر اتوفاژی بهمنظور بررسی دخالت این مسیر در کاهش توان حیاتی سلولها در تیمارهای مختلف بررسی شد که بهطور مجتمع در تصویر شماره 7 مشاهده میشود.
تیمار با siRNA سبب کاهش بیان ژنهای atg5 ،dram و beclin شده است، درحالیکه اثر معناداری بر بیان lc3 نداشته است. عدم فعال شدن مسیر اتوفاژی در تیمار با siRNA نشان میدهد که این مسیر در کاهش توان حیاتی سلولها دخیل نبوده است (تصویر شماره 4). تیمار با کوئرستین سبب افزایش بیان چشمگیر lc3 و همچنین افزایش بیان beclin شده است، درحالیکه اثر معناداری بر بیان atg5 و dram نداشته است.
در تیمار همزمان (siRNA + کوئرستین)، حضور siRNA سبب تشدید اثر کوئرستین بر افزایش بیان lc3 میشود، درحالیکه کاهش بیشتری را در بیان atg5 و dram باعث شده است. باتوجهبه افزایش بیان lc3 در تیمار کوئرستین و تیمار همزمان (siRNA+کوئرستین) فعال شدن مسیر اتوفاژی سبب کاهش 55 درصدی و 65 درصدی توان حیاتی سلولها در 2 تیمار ذکرشده است (تصویر شماره 4). کاهش و یا عدم تغییر معنادار بیان atg5 ،dram و beclin در تیمارهای انجامشده احتمال بروز اتوفاژی را از مسیرهای معمول و کانونیکال منتفی میکند. بنابراین اتوفاژی احتمالاً از مسیرهای غیرمعمول راهاندازی شده است که در بخش بحث مورد بررسی قرار خواهد گرفت. میزان بیان ژنهای مسیر بقای akt/mTOR درتیمارهای مختلف بررسی شد که نتایج آن بهطورکلی در تصویر شماره 8 مشاهده میشود.
بحث
در این مطالعه بهمنظور القای مرگ سلولی در سلولهای سرطانیMCF-7 ، از siRNA-DFF45 برای کاهش بیان ژن dff45 همزمان با داروی کوئرستین استفاده شد. توالیهای siRNA طراحیشده، به بخش کدکننده mRNA متصل میشود بهنحویکه نوکلئوتیدهای 331 تا 353 از mRNA ژن dff45 را در ناحیه کدکننده پوشش میدهد [11]. اکثر داروهای ضدسرطان ازطریق القای آپوپتوز موجب از بین رفتن سلولهای سرطانی میشوند، اما همواره مرگ سلولی القاشده توسط داروها از مسیر آپوپتوز سبب مرگ سلولی نمیشوند که در این پژوهش نیز مورد تأیید قرار گرفته است [28].
باتوجهبه تصویر شماره 6 در زمان تیمار سلولها با siRNA-DFF45 و کاهش بیان dff45، میزان بیان ژنهای p53 ،bax ،bcl-2 و caspase-3 کاهش یافت. کاهش بیان p53 بیانگر عدم بروز اثرات سیتوپلاسمی آن و عدم وقوع آپوپتوز است که کاهش مشاهدهشده در بیان caspase-3 نیز تأییدکننده آن است [29]. عدم افزایش معنادار در ژن aif نیز وقوع آپوپتوز غیروابسته به کاسپاز را منتفی میکند [30]. کاهش بیان akt1 که مهمترین عامل کینازی در حفظ بقای سلولی است با توقف مسیرهای رشد و بقای سلول، میتواند دلیل کاهش قدرت بقای سلولی، علیرغم کاهش mTOR در تیمار با siRNA باشد (تصویر شماره 8) [31] و این مطلب میتواند بیانگر دلیل کاهش 30 درصدی توان حیاتی سلولها در تیمار با siRNA-DFF45 باشد (تصویر شماره 4).
در تیمار مستقل کوئرستین، کاهش بیشتر سطح بیان ژنهای p53 و bcl-2 نسبت به تیمار siRNA-DFF45 مشاهده شد (تصویر شماره 6). در تیمار کوئرستین کاهش بیش از حد bcl-2 سبب شده است که علیرغم ثبات مشاهدهشده در bax، نسبت bax/bcl-2 افزایش معناداری را در قیاس با تیمار siRNA نشان دهد. افزایش این نسبت برخلاف معمول نمیتواند نشاندهنده تمایل سلولها نسبت به انجام آپوپتوز باشد، زیرا سطح بیان caspase-3 و p53 برخلاف مسیر آپوپتوز کاهش یافت. کاهش مشاهدهشده در سطح بیان p53 میتواند اثر مستقیم خود را در خروج آن از هسته و بروز آپوپتوز میتوکندریایی داشته باشد [32]. در مطالعات گذشته، تأثیر کوئرستین بر تحریک مسیر اتوفاژی در سرطان تخمدان بررسی شده است [33]. نتایج این مطالعات نشان داده است که کوئرستین میتواند بهواسطه p-STAT3/Bcl-2 موجب فعالسازی مسیر اتوفاژی شود. همچنین کاهش شکل هستهای p53 میتواند با کاهش بیان ژنهای آپوپتوزی از جمله caspase-3 همراه شود. کاهش بیان p53 معمولاً با افزایش بیان bcl-2 همراه است، زیرا p53 از بیان bcl-2 جلوگیری میکند [34]. در این مطالعه نتایج حاصل از اتوفاژی مورد تأیید قرار گرفته است. بنابراین کاهش بیان bcl-2 که بهطور چشمگیری در تیمارهای کوئرستین و (siRNA+کوئرستین) مشاهده شد را میتوان بهواسطه راهاندازی مسیر اتوفاژی تفسیر کرد [35].
علاوهبر نقش Bcl-2 در مهار آپوپتوز، Bcl-2 بهعنوان یک پروتئین کنترلی مهم در فرایند اتوفاژی شناخته شده است [36]. بیان بیش از حد پروتوانکوژن bcl-2 در 50 تا 70 درصد از سرطانهای پستان دیده میشود و سبب مقاومت سلولهای سرطانی به درمان میشود [35]. مطالعات قبلی نشان میدهد که خاموش کردن ژن bcl-2 بهوسیله siRNA در سلولهای MCF-7 سرطان پستان سبب القای lc3 ،atg5 و beclin-1 میشود که ازجمله پروتئینهای پیشبرنده اتوفاژی در مسیر کانونیکال هستند [37]. Bcl-2 با اتصال به Beclin-1 سبب مهار اتوفاژی میشود. فسفریله شدن Bcl-2 بهوسیله JNK-1 در پاسخ به تنش سلولی باعث جدایی Beclin-1 و Bcl-2 شده و اتوفاژی به راه میافتد [38]. بنابراین کاهش چشمگیر میزان Bcl-2 در تیمارهای کوئرستین و siRNA+کوئرستین میتواند سبب کاهش اثر مهاری Bcl-2 بر Beclin-1 و فعال کردن مسیر اتوفاژی شود. بنابراین میتوان گفت سازوکار مرگ سلولی اعمالشده توسط کوئرستین، راهاندازی مسیرهایی به غیر از آپوپتوز وابسته به کاسپاز است. افزایش مشاهدهشده در سطح بیان aif در تیمار کوئرستین نسبت به نمونه کنترل، میتواند نمایانگر به راه افتادن مسیر آپوپتوز غیروابسته به کاسپاز باشد (تصویر شماره 6) [39]. aif یک فلاووپروتئین با فعالیت اکسیدوردوکتازی است که در شرایط القای مرگ سلولی، با اتصال به DNA و فعال کردن نوکلئازهای دیگر سبب پیش بردن متراکم شدن کروماتین و شکست DNA میشود. بهعلاوه در زمان تیمار مستقل کوئرستین افزایش چشمگیر بیان lc3 و همچنین افزایش beclin مشاهده شد که نشاندهنده راهاندازی مسیر اتوفاژی است (تصویر شماره 7).
در تیمار کوئرستین کاهش بیان akt1 علیرغم کاهش بیان mTOR و pten با کاستن از توان حیاتی سلولها، اتوفاژی را به سمت مرگ پیش میبرد (تصویر شماره 8) [40]. بنابراین در تیمار مستقل کوئرستین افزایش مشاهدهشده در بیان aif همزمان با اتوفاژی سبب القای مرگ سلولی میشود که بیانگر علت کاهش 55 درصدی توان حیاتی سلولهاست (تصویر شماره 4).
در تیمار سلولها با siRNA+کوئرستین کاهش مشاهدهشده در بیان ژنهای p53 ،bcl-2 و caspase-3 از تیمارهای مستقل siRNA و کوئرستین بهمراتب بیشتر است که نشاندهنده اثرات همافزایی مرتبط با حضور siRNA است و باعث افزایش سازوکار مرگ سلولی القاشده توسط کوئرستین است. ازآنجاکه گزارشهای متعددی در رابطه با مهار آپوپتوز توسط اتوفاژی موجود است [41, 42]، بنابراین اتوفاژی مناسبترین انتخاب برای توجیه علت بروز مرگ در تیمارهای کوئرستین و siRNA+کوئرستین است. کاهش بیان aif نیز وقوع آپوپتوز غیروابسته به کاسپاز را منتفی میکند (تصویر شماره 6).
باتوجهبه تصویر شماره 7 در تیمار همزمان (siRNA+کوئرستین)، حضور siRNA سبب تشدید اثر کوئرستین بر افزایش بیان lc3 میشود. این یافته نمایانگر تمایل سلولها به انجام اتوفاژی است، اما کاهش بیان مشاهدهشده در atg5 و dram و عدم تغییر معنادار beclin نشان میدهد اتوفاژی به راه افتاده در این تیمارها میبایست از مسیرهای غیرمعمول روی داده باشد. این موضوع در پی کاهش بیان p53 و کاهش سطح سیتوپلاسمی آن در جهت تقویت اثرات هستهای و روشن شدن ژنهای اتوفاژی نیز تأیید میشود [43].
آزمون MTT روشی بر مبنای میزان تولید NADH در مسیر تنفسی میتوکندریایی است. بنابراین تیمارهایی که مسیرهای تنفسی میتوکندری را تحت تأثیر قرار میدهد میتواند بهعنوان یک عامل محدودکننده برای نتایج بهدستآمده باشد. در این مطالعه از روشهای پیشنهادشده در مطالعات گذشته استفاده شده است تا این تداخل اثر به کمترین میزان تقلیل یابد [44, 45].
نتیجهگیری
یکی از ویژگیهای اصلی سرطان، مقاومت به آپوپتوز بهدلیل جهش در ژنهای پروآپوپتوتیک و آنتیآپوپتوتیک و تغییر بیان آنهاست. همچنین اغلب درمانها در سرطان ازطریق فعال کردن مسیر آپوپتوز اثر کشندگی خود را نشان میدهند. درنتیجه دخالت در این مسیر میتواند به درمان سرطان کمک کند. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد تیمار دارویی رده سلولی MCF-7 با کوئرستین، همزمان با کاهش بیان ژن dff45 به کمک siRNA-DFF45 سبب القای مرگ سلولی میشود. بنابراین باتوجهبه نتایج مذکور میتوان گفت تیمار همزمان siRNA-DFF45 و کوئرستین سبب افزایش اثر کشندگی کوئرستین به میزان 10 درصد میشود که سازوکار اصلی در این همافزایی ازطریق اتوفاژی مرگ اعمال میشود. کوئرستین که یک آنتیاکسیدان طبیعی یافتهشده در گیاهان مختلف است، دارای خواص ضدسرطانی ثابتشدهای است و میتواند نقش مهمی در جلوگیری از سرطان پستان داشته باشد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این تحقیق با رعایت بالاترین استانداردهای اخلاقی انجام شده است. دادههای ارائهشده در این نسخه خطی تا جایی که ما میدانیم دقیق و معتبر هستند.
حامی مالی
این پژوهش هیچگونه کمک مالی از سازمانیهای دولتی، خصوصی و غیرانتفاعی دریافت نکرده است.
مشارکت نویسندگان
مفهومسازی، روششناسی، نرمافزار: سید جلال زرگر و شاهرخ صفریان؛ مدیریت دادهها و نظارت: سید جلال زرگر؛ نگارش، تهیه پیشنویس اصلی و تحقیق: تکتم سادات کلینی؛ نوشتن، بررسی و ویرایش: مصطفی صابریان؛ خوانش و تأیید نسخه نهایی: همه نویسندگان.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
References
References