Document Type : Original Article
Authors
Department of Exercise Physiology, Faculty of Sport Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran.
Abstract
Keywords
مقدمه
نارسایی مزمن کلیه با از بین رفتن پیشرونده و غیر قابل برگشت عملکرد کلیه مشخص میشود [1]. تظاهر بالینی CKD به صورت سندرم اورمیک است که معمولاً با کاهش شدید فیلتراسیون گلومرولی همراه است [2]. این بیماری به طور بارزی با تحلیل عضلات اسکلتی همراه است. ضعف بیش از اندازه بدن به علت آتروفی عضلانی دلیل مهم کاهش عملکرد جسمانی است که این آتروفی بیشتر در تارهای نوع 2 اتفاق میافتد. کاهش فعالیت و کاهش قدرت عضلانی با سرعت فیلتراسیون گلومرولی رابطه مستقیم دارد [3 ,4].
اختلالات عضلانی در CKD ممکن است با افزایش کاتابولیسم پروتئین یا کاهش سنتز آن و تغییرات در نسبت این دو، ایجاد شود. [5]. استرس اکسیداتیو ناشی از بیماریهای التهابی به عنوان دلیل اصلی آتروفی و تحلیل عضلانی شناخته شده است [6]. با توجه به عدم کارایی کلیه در CKD، فاکتورهای التهابی و استرس اکسیداتیو افزایش مییابد که در ارتباط با آتروفی عضلانی در بیماران کلیوی است. گونههای فعال اکسیژن میتواند از اختلال عملکرد میتوکندریها و افزایش NADpH Oxidase افزایش یابند. و به طور خاص با فعال کردن مسیرهای اتوفاژیا و از طریق فاکتورهای رونویسی FOXO، آتروژن 1 و MuRF-1 منجر به آتروفی عضلانی شود [7]. همچنین بر مسیر آپوپتوز میتوکندریایی و مایوستاتین عضله اسکلتی تأثیرگذار است. گونههای فعال اکسیژن باعث آزاد شدن سیتوکروم C از میتوکندری و متلاشی شدن سلول میشود. همچنین باعث افزایش Bax و Bak و کاهش Bcl-2 میشوند. در این میان پروتئینهای خانواده Bcl-2 کنترلکننده آزاد شدن سیتوکروم C از میتوکندری و آبشار کاسپازی هستند و نفوذپذیری میتوکندری را کنترل میکنند. با بیماری مزمن کلیوی سطح Bcl-2 در تمام بافتها مخصوصا بافت قلب، کلیه و میوسیتهای عضلانی کاهش مییابد و سطح Bax افزایش مییابد و در نتیجه آزادسازی سیتوکروم C از میتوکندری افزایش پیدا میکند و مسیر کاسپازی فعال میشود. افزایش Bax باعث فعال شدن کاسپاز 9 و درنهایت فعالسازی کاسپاز 3 خواهد شد؛ که روند آپوپتوز را افزایش خواهد داد [7, 8].
محققین گزارش کردند که فعالیت ورزشی میتواند از طریق کاهش پروتئین پییشآپوپتوزی Bax و افزایش پروتئین ضدآپوپتوزی Bcl-2 و درنتیجه مهار آزاد سازی سیتوکروم C مانع فعال شدن کاسپاز 9 شود و فعالسازی کاسپاز 3 را کاهش دهد که این امر منجر به تنظیم و کاهش روند آپوپتوز خواهد شد. ورزش با کاهش پروتئین Bax و متعاقب آن فعالیت کاسپاز آغازگر 9 و کاسپاز اجرایی 3 میتواند از دو مسیر داخلی و خارجی مانع آپوپتوز و قطعه قطعه شدن DNA شود [9, 10].
ورزشدرمانی میتواند یک استراتژی بالینی مؤثر برای بهبود مشکلات کلیوی و آسیبهای بعد از آن باشد [11]. پچتر و همکاران گزارش کردند که ورزش پروتئینوریا و ترشح سیستاتین C را کاهش میدهد و میزان فیلتراسیون گلومرولی را در بیماران مبتلا به CKD افزایش میدهد که متعاقب آن استرس اکسیداتیو کاهش مییابد و میتواند برای بیماران CKD مفید باشد [12]. کواک نشان داد که تمرینات ورزشی، افزایش مشکلات کلیوی را که ناشی از سن است، و همچنین نسبت Bax / Bcl-2 و سطح کاسپاز 9 را کاهش میدهد که نشاندهنده نقش حفاظتی فعالیت ورزشی بر عضله قلب موشهای صحرایی است [9].
یکی از ویژگیهای قابل توجه CKD، آپوپتوز عضله اسکلتی است. چندین مسیر ممکن است در آپوپتوز دخیل باشند، مانند مسیری که توسط فعالسازی JNK ایجاد میشود و افزایش سطح p-JNK، یکی از شاخصهای فعال شدن آپوپتوز است که میتواند بقایای فسفریلاته را در BAD و Bcl-xL فسفریله کند و همچنین منجر به رونویسی از چندین فاکتور شود که در آپوپتوز نقش دارند که با فعالیت بدنی سطح آن کاهش یافته است [9]. سیگنالینگ آپوپتوز قبل از تخریب پروتئینها در حین آتروفی عضلانی در حیوانات CKD و بیماران مشاهده میشود [13] که میتواند سیگنالینگ pro-apoptotic و بیشفعالی UPS را توضیح دهد. فعالیت بدنی با فعالسازی مسیر AKT و با کاهش پراکندگی DNA میتواند آپوپتوز را کاهش دهد [14].
در حال حاضر، هیچ مداخله دارویی مؤثری وجود ندارد که از آتروفی عضلات در شرایطی مانند CKD جلوگیری کند یا آن را کاهش دهد. با این حال برخی از موفقیتها در حفظ توده عضلانی در بیماران مبتلا به CKD با استفاده از تمرینات ورزشی به دست آمده است [15 ,16]. یکی از دلایل کاهش توده عضلانی در CKD افزایش آپوپتوز در بافت عضلانی است [7, 8]. استفاده از روشهای درمانی برای کاهش آپوپتوز میتواند منافعی تعویق انداختن و حفظ یا بازیابی توده عضلانی در بیماران CKD داشته باشد. با وجود این تحقیقی که به طور خاص اثر ورزش بر عوامل مؤثر بر آپوپتوز در بافت عضلانی انجام نشده است که نشاندهنده ضرورت تحقیق حاضر است.
با توجه به مطالب گفتهشده، پژوهش حاضر درصدد آن است که تأثیر تمرین هوازی تداومی را بر میزان شاخصهای آپوپتوزی در عضله رتهای صحرایی با بیماری مزمن کلیوی مورد مطالعه قرار دهد.
روش بررسی
در پژوهش توسعهای حاضر که با طرح پسآزمون انجام شد، 30 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار خریداری شدند و به 3 گروه بیمار تمرین، بیمار کنترل و سالم کنترل تقسیم شدند. بعد از القای CKD و گذشت 2 هفته نقاهت و دو هفته آشناسازی، دوره تمرینی آغاز شد. در طول پژوهش موشها در قفسهای پلیکربنات شفاف نگهداری شدند. چرخه روشنایی به تاریکی 12:12 و دمای محیط 22 درجه سانتیگراد و رطوبت 50 درصد در نظر گرفته شد. تغذیه موشهای صحرایی به صورت پلت که حاوی ترکیب مشخصی از انواع مواد مغذی مورد نیاز حیوان است، تهیه شد.
مراحل القای CKD: رتها از حیوانخانه به مرکز پژوهش منتقل شدند. در اتاق بیهوشی با توجه به زمان فرا رسیدن جراحی هرکدام به صورت نوبتی، فرایند بیهوشی انجام شد. ابتدا حیوانها در داخل باکس CO2 قرار داده شدند، تا زمانی که بتوان آنها را کنترل کرد. سپس از محفظه بیرون آورده شدند و 0/3 سیسی مواد بیهوشی مخلوط کتامین و زایلازین به صورت داخل صفاقی به آنها تزریق شد. بعد از تزریق برای اینکه شرایط مساعد برای بیهوشی فراهم شود، چراغ روشنایی اتاق خاموش شد و به حیوان فرصت داده شد که به طور کامل بیهوش شود. بعد از بیهوشی کامل حیوانات به اتاق جراحی منتقل شدند. از زیر دنده حیوان به سمت پایین به ابعاد تقریبی 6-4 سانتیمتر تراشیده شد. سپس با پنبه الکلی محل جراحی کاملاً ضدعفونی شد. برش با تیغ و قیچی در ناحیه خط وسط شکم ایجاد شد. کلیه چپ زیر طحال رؤیت و بهآرامی از شکم خارج شد. بعد از این مرحله کپسول کلیوی، چربی اطراف آن، و فاسیای کلیوی، پاره شد و کلیه آزاد شد. یکسوم بالایی و پایینی کلیه برداشته شد و بافتهای اضافی که نکروز شده بودند، با قیچی مخصوص بافت جدا شد. در انتها از یک لایه سرجی سل در دوطرف کلیه برای جلوگیری از خونریزی احتمالی استفاده شد. . یکسوم باقیمانده کلیه به طور تقریبی در جای خود قرار داده شد و عضله و پوست به طور جداگانه با نخ جذبی و با روش ساده پیوسته بخیه شدند. در انتها پوست دوباره با الکل ضدعفونی شد. برای جلوگیری از عفونت از سفازولین استفاده شد که به صورت درونعضلانی به ران حیوان تزریق شد. در انتها بعد از به هوش آمدن نسبی، حیوان به قفس انتقال داده شد. بعد از 2 هفته دوره نقاهت و سازگاری نسبی حیوان، مرحله دوم جراحی اجرا شد. در این مرحله پس از بیهوشی و آمادهسازی حیوان، کلیه راست بیرون آورده شد و با پاره کردن کپسول کلیوی، چربی اطراف آن و فاسیای کلیوی، آزاد شد. عروق کلیه از ناحیه انتهایی با نخ silk بدون سوزن بسته شد و کلیه به صورت کامل نفرکتومی شد. بعد از اطمینان از خونریزی نکردن محل برش نخ، قیچی شد و عروق باقیمانده دوباره به داخل شکم منتقل شد و پس از بخیه محل جراحی، مکان جراح با الکل ضدعفونی شد. برای جلوگیری از عفونت، سفازولین به صورت درونعضلانی تزریق شد. در انتها بعد از به هوش آمدن نسبی، حیوان به قفس نگهداری انتقال داده شد. پروتکل تمرین: بعد از دو هفته دوره آشناسازی و سازگاری با تمرین، پروتکل اصلی آغاز شد. در تحقیق حاضر تمرینات ورزشی به صورت تمرینات هوازی تداومی با شدت 55-45 درصد VO2max موشها در نظر گرفته شد که جزئیات پروتکل تمرین در جدول شماره 1، بیان شده است.
اندازهگیریها: 48 ساعت بعد از آخرین جلسه تمرین، حیوانات به آزمایشگاه منتقل و تشریح شدند. بافت عضله EDL از بدن حیوان جدا شد و در محلول فرمالین 10 درصد قرار داده شد. پس از سپری شدن 5 روز از زمان فیکس بافتی، ابتدا با استفاده از تکنیک اوریتیتور و رعایت اصول IUR برشهایی از بافت عضله EDL تهیه و با انجام مراحل پاساژ (با استفاده از دستگاه اتوماتیک هیستوکینت مدل 2000 ساخت شرکت لایکا) و آمادهسازی قالبهای پارافینی با استفاده از دستگاه میکروتوم دورانی مدل 820، برشهای متوالی به ضخامت 5 میکرومتر جهت مطالعات ایمونوهیستوشیمی تهیه شد. از عضله به طور تصادفی 5 برش نازک غیرمتوالی به ضخامت 5 میکرومتر جهت بررسی ایمونوهیستوشیمیایی بیان پروتئینی Bcl-2 و 5 برش نازک دیگر جهت بررسی ایمونوهیستوشیمیایی بیان پروتئینی Bax انتخاب شد. تکنیک ایمونوهیستوشیمی به روش انویژن و با استفاده از آنتیبادی اختصاصی Bcl-2 و Bax انجام شد. برای سنجش mRNA Bcl-2 و Bax نیز از روش Real Time PCR استفاده شد.
برای تجزیهوتحلیل آماری ازآزمون آماری تحلیل واریانس یکطرفه و آزمون تعقیبی توکی استفاده شد و سطح معنیداری 05/0≥P در نظر گرفته شد. جهت تجزیهوتحلیل دادهها از نرمافزار SPSS نسخه 26 استفاده شد.
یافتهها
نتایج آزمون شاپیروویلک نشان داد که تمامی متغیرها دارای توزیع نرمال هستند (0/05<P)؛ همچنین در بررسی تجانس واریانسها، نتایج آزمون لون نشان داد که تفاوت معنیداری بین واریانس متغیرها در گروههای تحقیق وجود ندارد (0/05<P). برای مقایسه متغیرهای بررسیشده بین گروههای تحقیق، از آزمون تحلیل واریانس یکطرفه استفاده شد که نتایج آن در جدول شماره 2، ارائه شده است.
نتایج آزمون تحلیل وایانس یکطرفه (جدول شماره 2) نشان داد که تفاوت معنیداری در سطح پروتئین و بیان ژن Bax و Bcl-2 و همچنین نسبت Bax به Bcl-2 در گروههای تحقیق وجود داشت (0/001>P). به منظور یافتن محل تفاوت از آزمون تعقیبی توکی استفاده شد که نتایج آن در جدول شماره 3، ارائه شده است.
بحث
نتایج تحقیق ما نشان داد که القای CKD موجب افزایش بیان ژن و پروتئین Bax در بافت عضلانی موشها شد. Bax یکی از عوامل پیشآپوپتوزی است که نقش واسطهای در راهاندازی سیگنالینگ آپوپتوز دارد و با افزایش نفوذپذیری میتوکندری و در تعامل با افزایش سطوح سیتوکروم C در مرگ سلولی نقش دارد [17]. گروس و همکارانش گزارش کردند که Bax در پاسخ به یک سیگنال مرگ که شامل هم دیمریزاسیون و درج غشای انتگرال میتوکندری است، دچار یک تغییر ساختاری میشود. علاوه بر این، یک سیگنال مرگ فیزیولوژیکی و خروج یک عامل بقا، منجر به انتقال Bax از سیتوزول به میتوکندری در سلولهای FL5.12 میشود. همچنین آنها گزاش کردند که Bax سیتوزولی نشاندهنده یک مونومر غیرفعال است که یک محرک مرگ باعث تغییر ساختاری در Bax و یا آزاد شدن Bax از یک چاپرون سیتوزولی میشود و پیکربندی فعال آن را به عنوان یک پروتئین غشایی میتوکندریایی انتگرال دیمر شده امکانپذیر میکند [18]. لی و همکاران نیز در تحقیقشان گزارش کردند که Bax نقشی محوری در سیگنالینگ آپوپتوز وابسته به میتوکندری دارد [19]. رضوی مجد و همکاران نیز نقش CKD را در افزایش Bax تأیید کردند [20] که با نتایج تحقیق حاضر همخوانی دارد. افزایش Bax در تحقیق حاضر را میتوان به دلیل افزایش بیان ژن Bax نسبت داد که احتمالاً به علت عوارض CKD از جمله افزایش فاکتورهای التهابی و رادیکالهای آزاد است و به علت کاهش عملکرد کلیوی ناشی از CKD ایجاد شده است [21]. البته در تحقیق حاضر سطوح فاکتورهای التهابی و رادیکالهای آزاد اندازهگیری نشد که از محدودیتهای تحقیق حاضر است. از طرفی نتایج نشان داد که مداخله تمرین هوازی تداومی موجب کاهش بیان ژن و پروتئین Bax در عضله EDL موشهای مبتلا به CKD شد. بنابراین میتوان نتیجهگیری کرد که مداخله تمرینات ورزشی از بیان ژن و پروتئین Bax جلوگیری میکند و میتواند با کاهش این عامل پیشآپوپتوزی احتمالاً از راهاندازی آپوپتوز جلوگیری کند. در تأیید یافتههای ما، چن و همکاران نیز در تحقیقشان گزارش کردند که مداخله فعالیت بدنی موجب کاهش بیان Bax در بافت کلیه موشهای مدل CKD شد [10] که نشاندهنده نقش تمرینات هوازی منظم بر کاهش Bax به عنوان یک عامل پیشآپوپتوزی است.
از طرف دیگر خانواده Bcl-2 یکی دیگر از عوامل مؤثر بر آپوپتوز سلولی هستند که در بقا و مرگ سلولی نقش تعدیلی دارد [22]. Bcl-2 با کنترل سیگنالهای داخل سلولی پیشآپوپتوز و ضدآپوپتوز نقش مهمی در تنظیم مرگ برنامهریزیشده سلول دارند [23]. در تحقیق حاضر سطح پروتئین Bcl-2 به عنوان یک عامل ضدآپوپتوزی از خانواده Bcl-2 سنجیده شد و نتایج تحقیق ما نشان داد که القای CKD موجب افزایش بیان ژن و پروتئین Bcl-2 در بافت عضلانی موشهای بیمار شد. پروتئینهای PROSurvival- Bcl-2 از مسیرهای مختلف از جمله تعامل و توقف پروتئینهای فعالگر BH3-only، آپوپتوز را سرکوب میکنند. همچنین پروتئینهای BH3-only (حساسکنندهها) نیز ممکن است به طور رقابتی با پروتئینهای PROSurvival ارتباط برقرار کنند و پروتئینهای فعالکننده BH3-only را آزاد کنند. در مدل خنثیسازی، نیز فعال شدن Bax و Bak توسط پروتئینهای pROSlvival Bcl-2 کنترل میشوند [24]. با توجه به نقش پروتئین Bcl-2 به عنوان یک عمل ضدآپوپتوزی میتوان کاهش بیان ژن و پروتئین Bcl-2 را یکی از دلایل تحلیل عضلانی مرتبط با آپوپتوز سلولی دانست. وانگ دونگ و همکاران نیز در پژوهشی که روی رتهای مدل CKD انجام دادند، گزارش کردند که در عضله اسکلتی رتهای CKD پروتئین Bax افزایش و Bcl-2 کاهش مییابد که این تغییر موجب راهاندازی کاسپاز 3 و آزاد شدن سیتوکروم C از میتوکندری و آپوپتوز سلول عضلانی میشود [25] که نتایج تحقیق وانگ دونگ با نتایج تحقیق ما همخوانی داشت. همچنین نتایج تحقیق حاضر نشان داد که افزایش معنیداری هم در پروتئین Bcl-2 در بافت عضلانی رتهای بیمار تمرین مشاهده شد که نشاندهنده اثر تمرین بر افزایش پروتئین Bcl-2، به عنوان یکی از عوامل مؤثر در بقای سلولی است. چن و همکاران نیز در تحقیقشان گزارش کردند که تمرینات هوازی اثر معنیداری بر افزایش Bcl-2 در کلیه رتهای مبتلا به CKD داشت [10]. رضوی مجد و همکاران نیز نتایج مشابهی متعاقب تمرینات هوازی بر افزایش Bcl-2 در کاردیوسیتهای رتهای مبتلا به CKD گزارش کردند [20] که نتایج این تحقیقات از یافتههای تحقیق ما حمایت میکنند.
آتروفی عضلانی و کاهش عملکرد عضلانی یکی از عوارض اصلی CKD است که منجر به کاهش کیفیت زندگی در این بیماران میشود [3 ,4، 26]. تحلیل عضله یک عارضه شایع در بیماران مبتلا به CKD است که کیفیت زندگی بیماران را کاهش میدهد و خطر ابتلا به مرگومیر آنها را افزایش میدهد [15]. یکی از عوامل اصلی آتروفی عضلانی در CKD افزایش آپوپتوز در بافت عضلانی است. با توجه به اینکه آپوپتوز سلولی تحت تأثیر تعامل فاکتورهای ضدآپوپتوزی و پیشآپوپتوزی است، نسبت این عوامل میتواند در بقا یا مرگ سلولی مؤثر باشد [20]. نتایج تحقیق حاضر نشان داد اگرچه القای CKD موجب افزایش نسبت پروتئین Bax به Bcl-2 (Bax/Bcl-2) میشود؛ ولی تمرینات ورزشی توانست موجب کاهش Bax/Bcl-2 نسبت به گروه بیمار کنترل شود. پتچر و همکارانش گزارش کردند که تمرینات ورزشی منظم با افزایش فیلتراسیون گلومرولی موجب کاهش استرس اکسیداتیو در CKD میشود [12]؛ با توجه به ارتباط بین استرس اکسیداتیو و راهاندازی سیگنالینگ آپوپتوز [27] میتوان گفت که احتمالاً اثرات تمرینات هوازی بر کاهش آپوپتوز در تحقیق حاضر به خاطر اثرات ضداکسیداتیو تمرینات ورزشی باشد. کواک نیز نشان داد که تمرینات ورزشی، نسبت Bax / Bcl-2 در کلیه را کاهش میدهد [9]؛ رضوی مجد و همکاران نیز نتایج مشابهی متعاقب تمرینات هوازی، بر کاهش Bax / Bcl-2 در کاردیوسیتهای رتهای مبتلا به CKD گزارش کردند [20]که نتایج این تحقیقات با یافتههای تحقیق ما همخوانی دارند.
مشخص شده است که به هم خوردن تعادل بین Bax و Bcl-2 و کاهش Bax/Bcl-2 میتواند از مرگ سلولی جلوگیری کند [22]. درواقع تمرینات ورزشی یکی از عوامل مؤثر بر افزایش سطح Bcl-2 به عنوان مهمترین عامل ضدآپوپتوتیک و کاهش Bax به عنوان یکی از عوامل راه انداز آپوپتوز است [28, 29] که میتواند با اثرات مثبتی از جمله فاکتورهای رشد و بقای سلولی و کاهش عوامل مرتبط با مرگ سلولی از تحلیل عضلانی جلوگیری کرده و احتمالاً موجب کاهش تحلیل عضلانی در بیماران CKD شود.
نتیجهگیری
نتایج تحقیق حاضر نشان داد که القای CKD با افزایش Bax و کاهش Bcl-2 میتواند موجب افزایش سیگنالینگ آپوپتوز در بافت عضلانی شود. از طرف دیگر تمرینات هوازی تداومی توانست از افزایش Bax / Bcl-2 ناشی از القای CKD در عضله EDL جلوگیری کند و احتمالاً با مهار سیگنالینگ آپوپتوز موجب حفظ توده عضلانی در بیماران مبتلا به CKD شود. با توجه به نتایج بهدستآمده و نقش مثبت تمرینات ورزشی در جلوگیری از آپوپتوز بافت عضلانی و با توجه به اینکه تاکنون درمان قطعی دارویی برای جلوگیری از تحلیل عضلانی بیماران CKD وجود ندارد، پیشنهاد میشود که تحقیقات بالینی آینده به منظور ارائه و توصیه تمرینات ورزشی مناسب برای بیماران CKD انجام شود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
تمام مراحل اجرا در تحقیق حاضر، بر اساس اصول بیانیه هلسینکی و تأیید کمیته اخلاق در پژوهش پژوهشگاه تربیتبدنی و علوم ورزشی رعایت شد (کد اخلاق: IR.SSRI.REC.1400.1008).
حامی مالی
تحقیق حاضر بخشی از رساله دکتری نویسنده اول در گروه فیزیولوژی ورزشی، دانشکده علوم ورزشی، دانشگاه خوارزمی، تهران است.
مشارکت نویسندگان
مفهومسازی: محمود جعفری، پژمان معتمدی؛ تحقیق و بررسی: تمامی نویسندگان؛ ویراستاری و نهاییسازی نوشته: محمود جعفری.
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.
References