کلونینگ و بیان ژن اینترفرون آلفاb2ی انسانی در سیستم بیانی اشرشیاکلی

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشکدۀ علوم کشاورزی، دانشگاه پیام نور کرج، ایران

2 دانشکدۀ علوم کشاورزی، دانشگاه پیام نور کرج، ایران.

3 گروه زیست‌شناسی، دانشکدۀ علوم، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران.

4 گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه پیام نور تهران، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: اینترفرون‌ها وسیلة دفاعی بدن علیه ویروس‌ها هستند که به سرعت در بدن تولید شده، سلول­های اطراف را به تولید پروتئین‌هایی که تکثیر ویروس را مهار، یا پاسخ ایمنی و رشد سلولی را کنترل می‌کنند، تحریک می‌کنند. با ‌توجه به اهمیت دارویی اینترفرون آلفا b2 انسانی در ایران و جهان، تولید این دارو در داخل کشور و از طریق بیوشیمیایی امکان‌پذیر اما بسیار مشکل می‌باشد. زیرا تولید این پروتئین توسط سلول‌های سالم بسیار کم انجام می‌شود. هدف‌ از این تحقیق، همسانه‌سازی (Cloning) و بیان ژن اینترفرون آلفا b2 انسانی در باکتری اشرشیاکلی در یک سیستم بیانی مناسب جهت امکان هدایت پروتئین تولید‌شده به فضای پریپلاسمی باکتری است. بیان در پریپلاسم، فضای عالی برای تشکیل پیوند‌های صحیح و پیچش صحیح ایجاد می‌کند. ناخالصی پروتئین و فعالیت پروتئازها در پریپلاسم کمتر از سیتوپلاسم است و تخریب و تجزیه پروتئین‌ها در پریپلاسم کمتر اتفاق می‌افتد.
روش بررسی: ژن اینترفرون آلفاb2 پس از تکثیر با آغازگرهای اختصاصی در ناقل بیانی  (+)pET-26b تحت کنترل پروموتور T7 و پپتید نشانه پریپلاسمی pelB  و با استفاده از آنزیم‌های برشی NcoI و XhoI کلون گردید و به باکتری اشرشیاکلی سویه (DE3)BL21 منتقل گردید. همسانه‌سازی ژن اینترفرون ‌آلفا در ناقل بیانی pET-26b(+) با استفاده از Colony PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی، تأیید شد. سپس بیان ژن اینترفرون ‌آلفا با استفاده از آنالیز بلات نقطه‌ای در فضای پریپلاسمی و به­صورت پروتئین کل در زمان­های مختلف پس از القاء با IPTG مورد‌ بررسی قرار گرفت.
یافته‌ها: با استفاده از آنالیز بلات نقطه­ای تأیید شد که پروتئین نوترکیب اینترفرون آلفاb2 در سیستم بیانی اشرشیاکلی تولید و وارد فضای پریپلاسمی باکتری شده است.
نتیجه­گیری: این تحقیق می­تواند امکان تولید پروتئین مهم اینترفرون آلفاb2 انسانی نوترکیب را در شکل صحیح خود و با صرف هزینه‌های بسیار پائین‌تر فراهم آورد.

کلیدواژه‌ها


1-Jadhav T, Jahidul Md. Cloning and production of Interferon alpha (IFNalfa). Report Version(1).Skövde University; 2009.

2-Gresser I, Maury C, Carnaud C, De Maeyer E, Maunoury MT, Belardelli F. Anti-tumor effects of interferon in mice injected with interferon-sensitive and interferon-resistant Friend erythroleukemia cells. VIII. Role of the immune system in the inhibition of visceral metastases. Int J Cancer 1990;46(3):468–74.

3-Salunkhe S, Soorapaneni S, Prasad KS, Raiker VA, Padmanabhan S. Strategies to maximize expression of rightly processed human interferon alpha2b in Pichia pastoris. Protein Expr Purif 2010;71(2):139-46.

4-Goldstein D, Laszlo J. The role of interferon in cancer therapy: a current perspective. CA Cancer J Clin 1988;38(5):258–77.

5-Cooksley WG. The role of interferon therapy in hepatitis B. MedGenMed 2004;6(1):16-25.

6-Rabhi-Essafi I, Sadok A, Khalaf N, Fathallah DM. A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon alpha as a GST-fusion protein in E.coli. Protein Eng Des Sel 2007;20( 5):201-9.

7-Ramanan RN, Tik WB, Rajabi Memari H, Azaman SNA, Ling TC, Tey BT, et al. Effect of signal sequences and promoters in producing recombinant human interferonα-2b in E.coli. Afr Biotechnol J 2010;9(3):285-92.

8-de Veer MJ, Holko M, Frevel M, Walker E, Der S, Paranjape JM, et al. Functional classification of interferon-stimulated genes identified using microarrays. J Leukoc Biol 2001;69(6):912–20.

9-Arlen PA, Falconer R, Cherukumilli S, Cole A, Cole AM, Oishi KK, et al. Field production and functional evaluation of chloroplast-derived interferon-alpha2b. Plant Biotechnol J 2007;5(4):511-25.

10-Tissot G, Canard H, Nadai M, Martone A, Botterman J, Dubald M. Translocation of aprotinin, a therapeutic protease inhibitor, into the thylakoid lumen of genetically engineered tobacco chloroplasts. Plant Biotechnol J 2008;6:309-20.

11-Goeddel DV. Expression of heterologous proteins in E.Coli. Methods Enzymol 1990;185:3-7.

12-Hodgson J. Expression systems: A user's guide. Emphasis has shifted from the vector construct to the host organism. BioTechnol 1993;11:887-93.

13-Frommer WB, Ninnemann O. Heterologous expression of genes in bacterial, fungal, animal, and plant cells. Ann Rev Plant Phys 1995;46(2):419-44.

14-Fuh G, Mulkerrin MG, Bass S, McFarland N, Brochier M, Bourell JH, et al. The human growth hormone receptor. Secretion from Escherichia coli and disulfide bonding pattern of the extracellular binding domain. J Biol Chem 1990;265(6):3111-5.

15-AkramiAbarghuei H. Cloning & Expression of human interferon alpha2 in E.coli [dissertation]. Tehran: Tarbiat Moddares Univ; 1998. [In Persian]

16-Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. p.1448.

17- Sørensen HP, Mortensen KK. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol 2005;115(2):113-28.

18-Kiani J. [Principles of expression recombinant proteines in E.coli]. Tehran: Andishe zohur; 2005. p.125. [In Persian]

19-Behravan J, Ahmadpour H. Cloning and characterization of directly amplified antiviral gene interferon alpha-2b (HuIFNalpha-2b) from human leukocytes chromosomal DNA. Arch Pharm Res 2004;27(7):776-80.