بررسی میزان کارآیی روش Real-Time PCR با استفاده از دو راهکار رسم منحنی استاندارد و رگرسیون خطی

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار گروه ایمونولوژی.گروه ایمونولوژی و مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشکدة پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جندی‌شاپور اهواز، ایران.

2 دانشجوی کارشناس ارشد گروه ایمونولوژی.گروه ایمونولوژی، دانشکدة پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جندی‌شاپور اهواز، ایران.

3 دانشیار گروه ایمونولوژی.گروه ایمونولوژی، دانشکدة پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جندی‌شاپور اهواز، ایران.

4 استادیار گروه ژنتیک پزشکی.گروه ژنتیک پزشکی و مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشکدة پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی جندی‌شاپور اهواز، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: آنالیز کمّیmRNA  با استفاده از Real-Time PCR  به­وسیله روش سایبرگرین به­طور وسیعی در مطالعات بیولوژیک کاربرد  بسیاری پیدا کرده است. هدف این تحقیق مقایسة کارآییPCR  محاسبه شده با استفاده از دو روش شیب خط نمودار استاندارد و نرم­افزارLinRegPCR  جهت تعیین استراتژی بهتر برای محاسبة کارآیی PCR می­باشد.
روش بررسی: در این پژوهش پس از خون­گیری و استخراج RNA و سنتز cDNAفرآیند  qRT-PCR انجام شد.سپس محاسبة PCR Efficiency به دو روش رسم منحنی استاندارد و همچنین با استفاده از نرم­افزارLinReg PCR انجام گرفت و در نهایت این دو روش آنالیز با هم مقایسه شدند.
یافته­ها: میزان کارآیی PCR محاسبه شده برای سه ژنGAPDH، TGF βو IL-10 با روش منحنی استاندارد به­ترتیب 99/1، 81/1 و 87/1 و همچنین با روش استفاده از نرم­افزار رایانه­ای LinReg PCR کارآیی این سه ژن به­ترتیب 98/1، 82/1 و82/1 به­دست آمد.
نتیجه­گیری: نتایج این تحقیق نشان می­دهد که در آنالیز داده­های حاصل از تکثیر cDNA میزان کارآییPCR  به­دست آمده برای سه ژن GAPDH، TGF β و  IL-10با دو روش مختلف منحنی استاندارد و LineRegPCR نتایج تقریباً یکسانی حاصل می­شود. بنابراین، توصیه می­شود که به­جای روش پرهزینه منحنی استاندارد از نرم­افزار LinReg PCR استفاده گردد.

کلیدواژه‌ها


1-Mullis KB. Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Clin (Paris) 1990;48:579–82.

2-Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res 1996;6:986–94.

3-Lockey C, Otto E, Long Z. Real-time fluorescence detection of a single DNA Molecule. Biotechniques 1998;24:744–6. 

4-Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol 2002;29:23-39.

5-Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immun 2005;6:279-84.

6-Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time Monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology(NY) 1993;11:1026–30.

7-Gibson UE, Heid CA, Williams PM. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res 1996;6:995–1101.

8-Orlando C, Pinzani P, Pazzagli M. Developments in quantitative PCR. Clin Chem Lab Med 1998;36:255–69.

9-Freeman TC, Lee K, Richardson PJ. Analysis of gene expression in single cells. Curr Opin Biotechnol 1999;10:579–82.

10-Schmittgen TD, Zakrajsek BA. Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression: validation by real-time, quantitative RT-PCR. J Biochem Biophys Methods 2000;46:69–81

11-Bustin SA Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription Polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinal 2000;25:169–93.

12-Steuerwald N, Cohen J, Herrera RJ, Brenner CA. Analysis of gene expression in single oocytes and embryos by real-time rapid cycle fluorescence monitored RT-PCR. Mol Hum Reprod 1999;5:1034–9.

13-Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res 2002;30:1292–305

14-Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. Trends Mol Med 2002;8:257-60.

15-Mocellin S, Rossi CR, Pilati P, Nitti D, Marincola FM. Quantitative real-time PCR: a powerful ally in cancer research. Trends Mol Med 2003;9:189-95.

16-Mason G, Provero P, Vaira AM, Accotto GP. Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR. BMC Biotechnol 2002;2:20.

17-Skern R, Frost P, Nilsen F. Relative transcript quantification by quantitative PCR: roughly right or precisely wrong?. BMC Mol Biol 2005;6:10.

18-Livak K. ABI Prism 7700 Sequence Detection System[Internet]. User Bulletin2. 1997 [cited 1997]. Available from: http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf.

19-Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res 2001;29: e45.

20-Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett 2003;339:62-6.

21-Cikos S, Bukovska A, Koppel J. Relative quantification of mRNA: comparison of methods currently used for real-time PCR data analysis. BMC Mol Biol 2007;8:113.

22-Lee KY, Ito K, Hayashi R, Jazrawi EP, Barnes PJ, Adcock IM. NF-kappaB and activator protein 1 response elements and the role of histone modifications in IL-1beta-induced TGF-beta1 gene transcription. J Immunol 2006;176:603-15.