مقایسۀ کمی و کیفی روش‌های CTAB و SDS برای تخلیص DNA از گیاه دارویی ماریتیغال (Silybum marianum L.)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار گروه بیوتکنولوژی.استادیار گروه بیوتکنولوژی دانشگاه رامین خوزستان.

2 دانش‌آموختۀ کارشناسی ژنتیک.دانش‌آموختۀ کارشناسی ژنتیک دانشکدۀ بهزیستی و توانبخشی خوزستان.

3 دانشجوی دکترای تخصصی رشتۀ اصلاح نباتات- ژنتیک مولکولی.دانشجوی دکترای تخصصی رشتۀ اصلاح نباتات- ژنتیک مولکولی دانشگاه زنجان.

4 دانشجوی دکتری تخصصی نانوبیوتکنولوژی مرکز علم و فناوری زیست شناسی، دانشکده و پژوهشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین (ع )، تهران، ایران

5 دانشیار گروه بیماری های گیاهی.دانشیار گروه بیماری های گیاهی، دانشگاه تربیت مدرس تهران.

چکیده

زمینه و هدف: معمولاً کیفیت DNA با عوامل مختلفی از جمله: عدم آلودگی ناشی از RNA، پروتئین، لیپید و سایر ساختارهایی که برای آنزیم تک پلیمراز (Taq Polymerase) در واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) و آنزیم­های برشی مزاحم، سنجیده می­شود. وجود ترکیبات فنلی و ترکیبات ثانویۀ دیگر، استخراج DNA از بافت برگ گیاه دارویی ماریتیغال (Silybum marianum L.) را جهت استفاده در مطالعات ژنتیکی و بیوتکنولوژی مشکل ساخته است.
روش­ بررسی: در این مطالعه دو روش استخراج DNA جهت استخراج از بافت برگ 11 تودۀ ماریتیغال مورد مقایسه قرار گرفت. روش نخست بر اساس روش SDS انجام شد و در روش دوم از دستورالعمل CTAB با انجام تغییراتی استفاده گردید. کمیت DNA استخراج شده با تعیین میزان جذب هر یک از نمونه­ها در طول موج های260 و 280 نانومتر به­وسیلۀ دستگاه اسپکتروفتومتر مشخص گردید. در این پژوهش کیفیت DNA از نظر وجود شکستگی و مقدار RNA استخراج شده به­وسیلۀ الکتروفورز با ژل آگارز ارزیابی شد.
یافته­ها: در میان روش­های به­کار گرفته شده جهت استخراج DNA از بافت برگ جمعیت­های ماریتیغال، روش CTAB از نظر کمیت و کیفیت DNA استخراج شده کارآیی پایینی داشت، در حالی­که روش SDS کارآیی مناسبی از نظر کمیت، کیفیت و خلوص DNA استخراج شده نشان داد.
نتیجه­گیری: از آنجایی­که نسبت 280A/260A­ بیش از 2 نشان­دهنده وجود RNA و تخریب زیاد DNA و نسبت کمتر از 8/1 نشان­دهندۀ وجود آلودگی پروتئینی در DNA است، باید گفت که در مطالعات ژنتیکی و کارهای مهندسی ژنتیک روشی برای تخلیص DNA مناسب­تر است که DNA با کیفیت و کمیت بالاتری تولید کند. بسیاری از مطالعات انجام گرفته نشان می­دهد که در گیاهان دارویی و گیاهانی که حاوی مواد پلی­فنلی و پلی­ساکارید بالایی هستند به­کارگیری روش تخلیص CTAB و روش­هایی که از نظر تکنیکی نزدیک به این روش هستند کارایی مناسب­تری نشان می­دهند. CTAB به عنوان یک ماده شوینده می­تواند با DNA تشکیل کمپلکس دهد و آن را از کربوهیدرات­ها و پروتئین­ها جدا نماید. پلی­ساکارید­های باقیمانده نیز به­وسیلۀ NaCl غلیظ حذف می­گردند.
 

کلیدواژه‌ها


1-Aelayie, M, Naderi, R, Khalighi, A, Vazvayie, A, Salami, SG 2008, Study on effective components on the quantity and quality of genomic DNA extracted from Iran cyclamen, Pajouhesh Va Sazandgi journal, Vol.73, No.3, Pp.11-16.

2-Zamani, T, Sarkhosh, A, Fatahi Moghadam, MR, Ebadi, A 2007, Comparison of six genomic DNA extraction methods from Pomegranate (Punica granatum L.), Olom va Fonoon Baghebani Iran, Vol.6, No.2, Pp.99-110.

3-Shakibayie, MR 2005, Biotechnology and recombinant DNA, Moasesye Kerman Taksir, Kerman.

4-Kadkhodayie, S 2005, Simple and low-cost method for the isolation of nucleic acids from plants containing high polysaccharides and polyphenols: optimization of DNA extraction method in Almond, Third biotechnology congress of Iran, Pp.417-419.

5-Ahmad, R, Ferguson, L, Southwick, S 2003, Identification of pistachio (Pistacia vera L.) nuts with microsatellite markers. J. Amer. Soc. Hort. Sci., Vol.128, Pp.898-903.

6-Ahmadikhah, A 2009, A rapid mini-prep DNA extraction method in rice (Oryza sativa L.), African Journal of Biotechnology, Vol.8, No.2, Pp.323-327.

7-Bushra, C, Afshan, Y, Tayyab, H, Riazuddin, S 1999, Mini-scale genomic DNA extraction from cotton. Plant Mol. Bio. Rep., Vol.17, Pp.1-7.

8-Cheng, YJ, Guo, WW, Yi, HL, Pang, XM, Deng, X 2003, An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Mol. Bio. Rep., Vol.21, Pp.177-177.

9-Fang, G,  Hammar, S, Grumet, R 1992, A quick and inexpensive method for removing poly saccharides from plant genomic DNA, Biotechniques, Vol.13, No.1, Pp.52-54.

10-Green, RL, Roinestad, IC, Boland, C, Hennessy, LK 2005, Developmental validation of the quantifiler real-time PCR kits for the quantification of human nuclear DNA samples, J. Forensic Sci., Vol.50, No.4, Pp.1-17.

11-Lodhi, MA, Ye, GN, Weeden, NF, Reisch, BI 1998, A simple and efficient method DNA extraction from grapevine cultivars and vitis species, Plant Mol. Bio.Rep.,Vol.12, No.1, Pp.6-13.

12-Loomis, MD 1974, Overcoming problems of phenolics and quinones in the isolation of plant enzymes and organelles. Methods Enzymol, Vol.31, Pp.528-544.

13-McCouch, SR 2002, A Brief Introduction to Rice DNA Technology, (http://www.ricelab.plbr.cornell.edu).

14-Poljak, M, Barlic, J, Seme, K, Avsic-Zupanc, T, Zore, A 1995, Isolation of DNA from archival Papanicolaou stained cytological smears using a simple salting-out procedure, J. Clin. Pathol., Vol.48, No.1, Pp.55-56.

15-Porebski, S, Bailey, LG, Baum, BR 1997, Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol. Biol. Reptr., Vol.15, NO.1, Pp.8-15.

16-Shokrpour, M, Mohammadi, SA, Moghaddam, M, Ziai, SA, Javanshir, A 2008, Variation in flavonolignan concentration of milk thistle (Silybum marianum) fruits grown  in Iran, journal of herb, species & medicinal plants, Vol.13, No.4, Pp.55-69.

17-Suman, PS, Khanuja, Ajit, K, Shasany, MP, Darokar, S, Kumar, S 1999, Rapid Isolation of DNA from Dry and Fresh Samples of Plants Producing Large Amounts of Secondary Metabolites and Essential Oils. Plant Mol. Biol. Reptr., Vol.17, No.1, Pp.1-7.

18-Weishing, K, Nybom, H, Wolff, K, Meyer, W 1995, DNA isolation and purification. In: DNA fingerprinting in plants and fungi, Pp.44-59. CRC Press, Boca Raton, Florida.